南极黄丝瓜藓（Pohlia nutans）2-酮戊二酸依赖性双加氧酶基因PnODD1在植物抗逆中的作用

发布时间：2020-07-06 15:54

【摘要】：南极洲位于地球南端,四周被三大洋包围,与其他大陆隔离,独特的地理位置造就了其独特的气候。酷寒、干燥、烈风和强紫外辐射等制约了陆生植物的生长发育。苔藓植物(Bryophyte)是南极大陆主要植被类群。黄酮类化合物是植物体内最大的一类次生代谢物,参与植物生长发育以及响应非生物胁迫。尽管类黄酮代谢途径在很多植物中得到了很好的研究,但在高等植物的低等类群中的研究却很少。目前,地钱查尔酮异构酶、小立碗藓查尔酮合酶和钝磷紫背苔黄酮合酶等少数基因被报道。2-酮戊二酸依赖性双加氧酶(2-oxoglutarate-dependent dioxygenase,2-ODD)是植物基因组中第二大酶家族,参与各种氧合/羟化反应,在植物和动物发育、转录调节、核酸修饰/修复和次级代谢合成途径中发挥重要作用。类黄酮代谢途径中的2-ODD家族基因也为丰富的黄酮类化合物形成提供保障。本文从南极黄丝瓜藓(Pohlia nutans)转录组中选取了一个高度响应UV-B的基因。生物信息学分析为类黄酮代谢途径关键2-ODD家族基因,命名为PnODDl(Pohlia nutan2 2-ODD1),并对其进行了克隆分析和功能研究。具体结果如下:1.强紫外辐射(UV-B)对南极黄丝瓜藓与新疆地区泛生丝瓜藓的影响本课题组研究发现,与山东地区的卵蒴丝瓜藓(Pohlia proligera)相比,南极黄丝瓜藓对紫外辐射的耐受性高,且这种抗性与黄酮类化合物相关。本文进一步研究了南极黄丝瓜藓与新疆泛生丝瓜藓(Pohlia cruda)对紫外辐射响应的差异。UV-B(70μW/cm2)辐射处理12h后,新疆泛生丝瓜藓植株出现弯曲和蓬乱、叶片皱缩、颜色变暗,部分植株顶端枯死,受损伤严重;而南极黄丝瓜藓仅有颜色变化,生长状态较好。与新疆泛生丝瓜藓相比,UV-B处理后南极黄丝瓜藓的活性氧自由基和丙二醛含量水平增幅较小,但却积累了更多的黄酮类化合物。同时,UV-B处理后,两种抗氧化酶在两种苔藓体内活性均显著提高,但是南极黄丝瓜藓抗氧化酶的提升幅度小于新疆泛生丝瓜藓。以上结果表明,南极黄丝瓜藓对紫外辐射的抗性较新疆泛生丝瓜藓强,这种抗性主要依赖于体内合成的大量黄酮类物质。2.南极黄丝瓜藓PnODD1的克隆、表达分析和功能研究从南极黄丝瓜藓转录组中选取了一个高度响应UV-B的基因,对其进行了克隆、表达分析和功能研究。生物信息学分析发现,该基因属于类黄酮代谢途径的2-ODD家族成员(PnODD1)。同时,疑是类无色花青素双加氧酶(LDOX/ANS-like)基因。PnODD1大小为1510 bp,含有一个1050 bp的ORF,编码346个氨基酸,蛋白分子量为38.4 kDa。多序列比对发现,PnODDl与其它2-ODD超家族基因的序列相似性为39.5-48.9%,具有典型N端保守的DIOX_N结构域和2-OD-FeⅡ_Oxy结构域;另外,与其它2-ODD一样,存在Fe2+结合位点残基(His219、Asp221 and His275)和AKG(2-酮戊二酸)结合位点残基(Tyr204、His219、Asp221、His275、Arg285和Ser287)。通过SWISS-MODEL进行了同源建模,空间结构显示,PnODD1蛋白由α-螺旋、β-折叠和无规卷曲三者在中央部位构成一个空腔,即为铁离子(Fe2+)结合位点。系统进化树分析发现,PnODD1与其他物种2-ODDs基于保守的结构和序列特征(如氨基酸同源性和保守基序)而共享一个共同的进化祖先;与钝磷紫背苔FNSI类聚同一分支,表明了二者具有很近的亲缘关系。通过生信在线预测以及PEG-CaCl2法介导的瞬时表达载体转入拟南芥原生质体的实验,研究了蛋白的亚细胞定位,结果显示PnODD1主要分布于细胞质膜和细胞质基质。利用RT-qPCR技术分析了PnDD1基因对非生物胁迫的响应。结果表明,PnODD1基因在D-Mannitol、UV-B、盐胁迫下均显著上调表达,说明其参与南极黄丝瓜藓适应环境胁迫。将PnODD1基因在拟南芥中组成型表达,研究了其生物学功能。正常生长状态下,过表达PnODD1对拟南芥的生长发育没有影响。过表达PnODD1增强了拟南芥对盐胁迫的抗性。在125mMNaCl胁迫下,Col-0、AtOE1和AtOE2种子萌发率分别是46.7%、91.7%和 86.7%;150 mM NaCl 胁迫下 Col-O、AtOE1 和AtOE2种子萌发率分别是35.0%、71.6%和75.3%;根长研究发现,在125mM或150mMNaCl处理下,过表达PnODD1拟南芥主根均显著长于野生型拟南芥。同时,过表达PnODD1增强了拟南芥对渗透胁迫的抗性。在0.1 M或0.3 M D-甘露醇处理后,过表达PnODD1拟南芥的种子萌发率、主根长度、植株鲜重以及侧根数目均显著高于野生型拟南芥。UV-B处理12h后,野生型拟南芥生长受到了明显的抑制,茎秆细小、叶片蜷皱和叶片表面积变小;过表达PnODD1缓解了UV-B对拟南芥生长的抑制效应。逆境条件会导致植物体内脱落酸(Abscisic acid,ABA)水平急剧升高,其抑制种子萌发,影响植物生长。过表达PnODD1降低了拟南芥对ABA的敏感性。1.0μMABA处理下,AtOE1和AtOE2种子萌发数分别是93.3%和91.7%,显著高于野生型的85.3%,过表达系的主根长度约为野生型的1.30倍。拟南芥总黄酮代谢谱分析发现,PnODD1影响了非生物胁迫下拟南芥体内黄酮类化合物的种类和含量。另外,渗透胁迫下,PnODD1通过影响干旱响应基因(P5CS1和AtKIN1)及ABA信号途径相关基因(AtABF3、AtMYB2、AtRD22和AtDDEB2A)的表达,增强了过表达拟南芥的抗旱性。通过构建原核表达载体,对PnODD1基因进行异源表达并优化了表达条件,确定了在诱导温度16℃、IPTG浓度0.11mM和诱导时间24h条件下重组蛋白表达量最高;利用HLPC进行了重组蛋白与多种底物的产物分析,发现PnODD1蛋白可以催化柚皮素(Naringenin,NAR)生成新化合物。体外NAR给养实验发现,过表达PnODD1缓解了NAR对植物生长的抑制作用。综上所述,PnODD1通过影响拟南芥体内黄酮类化合物含量和胁迫响应相关基因的表达,增强了植株对非生物胁迫的抗性,为揭示苔藓适应极地环境的特殊机制提供了重要参考,丰富了南极植物基因资源。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q943.2;Q945.78
【图文】：

黄酮类化合物,高等植物

物活性氧（Ｒｅａｃｔｉｖｅ邋ｏｘｙｇｅｎ邋ｓｐｅｃｉｅｓ，邋ＲＯＳ）的水平增加，与此同时，植物会诱导合逡逑成体内酚类和黄酮类化合物，以保护机体免受伤害。黄酮类化合物参与植物对生逡逑物和非生物胁迫的响应如图１－１所示。逡逑植物在生长发育过程中会遭受昆虫、线虫、真菌、原生生物、细菌和病毒的逡逑侵害，这个过程称为生物胁迫，是农业上农作物损失的首要问题（Ｂａｓｋａｒ以《／．，逡逑２０１２）。当病原体或害虫感染植物时，诱导植物黄酮类化合物合成（Ｂａｒｒｙ邋ｅ／邋ａ／．，逡逑２００２；邋Ｇａｌｌｅｔ以ａ／．，邋２００４）。在水稻中，发现了三种抑制昆虫消化并有褐飞虱的威慑逡逑作用的黄酮糖苷（Ｈａｒｂｏｍｅ邋ｄａ／．，邋２０００）。烟草中的芦丁和槲皮素通过抑制害虫虫逡逑卵正常发育，导致害虫存活率降低。花生中槲皮素和芦丁糖苷的含量与烟草粘虫逡逑（斜纹夜蛾）的死亡率增加有关（Ｍａｌｌｉｋａｒｊｕｎａ＾ａ／．，２００４）。还有学者发现棉花叶片逡逑表皮组织中的花青素积累会增加机体对野油菜黄单胞菌（沿ｗＡｏｍｏｎａｙ逡逑ｐｖ．邋ｍｏ／ｖａｃｅａｒａｗ）的抗性（Ｋａｎｇａｔｈａｒａｌｉｎｇａｍ邋ｅｆ邋ａ／”邋２００２）。逡逑干旱、强紫外辐射、重金属超标、高盐和高低温等对植物生长造成了胁迫，逡逑这些因素称为非生物胁迫。当植物暴露于非生物胁迫时

示意图,黄酮类,途径,查尔酮

１．３．１类黄酬代谢途径概述逡逑类黄酮代谢途径是植物次级代谢系统中研究最多的途径之一，它也是苯丙烷逡逑代谢途径的分支。其合成过程和关键基因如图１－２所示。苯丙氨酸在苯丙氨酸裂逡逑解酶邋（Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ邋ａｍｍｏｎｉａ－ｌｙａｓｅ，邋ＰＡＬ）、肉桂酸轻化酶逡逑（Ｃｉｎｎａｍａｔｅ－４－ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ，Ｃ４Ｈ）和邋４－香豆辅酶邋Ａ邋连接酶（４－Ｃｏｕｍａｒｏｙｌ：ＣｏＡ－ｌｉｇａｓｅ，逡逑４ＣＬ）的作用下合成了类黄酮代谢途径的前体化合物４－香豆酰辅酶Ａ，它与三分逡逑子N!二酰辅酶Ａ在查尔酮合成酶（Ｃｈａｌｃｏｎｅ邋ｓｙｎｔｈａｓｅ，ＣＨＳ，邋ＥＣ２．３．１．７４）催化下进逡逑行缩合，形成中间体－柚皮素查尔酮（Ｖｅｒｖｅｒｉｄｉｓ邋ｅＭ／．，２００７；邋Ｍｉｒａｎｄａ邋Ｗ邋ａ／．，邋２０１２）；逡逑此外，查尔酮还原酶（Ｃｈａｌｃｏｎｅ邋ｒｅｄｕｃｔａｓｅ，邋ＣＨＲ）与ＣＨＳ共同催化产生６＇－脱氧查逡逑尔酮，而后查尔酮异构酶（Ｃｈａｌｃｏｎｅｉｓｏｍｅｒａｓｅ，ＣＨＩ，邋ＥＣ５．５．１．６）催化查尔酮环化成逡逑相应的（２Ｓ）－黄烷酮（柚皮素）

表观形态,苔藓

３．１．１邋ＵＶ－Ｂ处理对苔藓长势和总黄酮代谢谱的影响逡逑自１９８０ｓ以来，氟利昂等物质的使用使地球的臭氧层变薄甚至造成空洞，到逡逑达南极大陆的紫外线急剧增多，导致当地植物暴露在强烈的紫外辐射下。课题组逡逑研究发现，与常温卵蒴丝瓜藓ＣＰｏＷ／ａ／？ｒａ／／ｇｅｒａ，来源山东）相比，南极黄丝瓜藓逡逑具有更强的抗紫外辐射能力（王太林，２０１７）。为了进一步比较南极黄丝瓜藓与逡逑常温苔藓对强紫外辐射的抗性差异，我们选择了另一种源于新疆的泛生丝瓜藓逡逑作为对象。分析了高强度ＵＶ－Ｂ处理对两种苔藓表观形态和黄酮类逡逑化合物代谢谱的影响。逡逑正常培养条件下，两株苔藓茎叶体翠绿、茎杆竖直，生长状态较好（图３－１邋ａ逡逑和ｃ）。将两组材料置于ＵＶ－Ｂ邋（７０邋ｊａＷ／ｃｍ２）辖射箱中处理１２邋ｈ后，新疆泛生丝瓜逡逑藓植株出现蜷缩、蓬乱的状态，顶端叶片干枯、弯曲；而南极黄丝瓜藓仅植株颜逡逑色略微变黄，生长状态较好（图３－１邋ａ和ｄ）。逡逑Ｃｏｎｔｒｏｌ逦ＵＶ－Ｂ邋（７０邋ｊｉＷ／ｃｍ２）逡逑

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