新型小麦—中间偃麦草异附加系的染色体结构重排鉴定与籽粒硬度基因分析

发布时间：2020-07-06 22:53

【摘要】：中间偃麦草(Thinopyrum intermedium,StStJ~sJ~sJJ,2n=42)是小麦野生近缘物种之一,原产于欧洲和西亚。中间偃麦草生长环境复杂多样,在长期进化过程中形成了丰富的形态变异,蕴含着大量逆境适应性基因,为小麦栽培品种的改良提供了丰富的高产、抗病、抗逆性基因资源。这些优异的基因资源只有导入到小麦背景中才能发挥出潜在的应用价值。开展小麦与中间偃麦草的远缘杂交,培育小麦-中间偃麦草部分双二倍体,进一步与栽培小麦品种回交,选育小麦-中间偃麦草衍生系,对偃麦草优异基因可持续利用具有重要的意义。在本研究中,我们从中国春(CS)与小麦-中间偃麦草部分双二倍体中2和中5杂交的BC_1F_6世代中,分别获得了中国春-中间偃麦草附加系Hy36和Hy37。我们利用新开发的中间偃麦草染色体组特异性的寡核苷酸探针,使用连续的非变性荧光原位杂交(ND-FISH)和分子标记等技术,系统分析了中间偃麦草、小麦与中间偃麦草部分双二倍体和两个新型小麦-中间偃麦草附加系等材料。运用这些技术准确地鉴定了中间偃麦草、小麦-中间偃麦草部分双二倍体和小麦-中间偃麦草附加系Hy36和Hy37的染色体组成。其次,我们利用这些材料克隆了源于中间偃麦草的硬度基因,并进行了分子系统进化分析。最后,我们还调查了两个衍生系的田间性状和籽粒品质表现。研究结果如下:(1)开发了新的特异性中间偃麦草寡核苷酸探针,运用连续ND-FISH技术,对六倍体中间偃麦草,小麦-中间偃麦草部分双二倍体中5、中2,附加系材料Hy36和Hy37的核型进行鉴定。我们发现中5(2n=56)含有14条中间偃麦草染色体,6条St、2条J~s和6条St-J~s易位染色体。中2(2n=54)包含42条小麦染色体和12条中间偃麦草染色体,分别为6条J~s染色体,2条St染色体,和4条St-J~s重组染色体。Hy36附加了1对偃麦草J~s-St易位染色体,Hy37附加了1对偃麦草J-St易位染色体。本研究利用多探针杂交中间偃麦草同一染色体,构建了中间偃麦草染色体的精细原位杂交核型,为后续中间偃麦草基因组的遗传、进化和育种应用研究奠定了基础。(2)基于90K SNP芯片、PLUG(PCR-based landmark unique gene)分子标记、IT(Intron targeting)分子标记和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,我们进一步确定了Hy36和Hy37附加染色体的基因组组成和同源群归属。发现Hy36和Hy37附加的染色体分别为5J~sS.3StS和5JS.3StS。(3)硬度基因Pina的克隆和测序。我们同源克隆了源于中间偃麦草的特异硬度基因Pina的全长序列,将该基因定位于Hy36所附加的重排染色体5J~s短臂上其蛋白序列的保守区间段色氨酸富集区(WRWWKWWK)位于第2个和第3个半胱氨酸残基之间。首次从偃麦草Pina蛋白序列中发现第70位氨基酸残基上发生了替换(精氨酸替换了赖氨酸)。(4)农艺性状观察与籽粒品质检测,通过田间试验,测定了Hy36、Hy37和CS的农艺性状。与Hy37相比,Hy36系列材料穗长较短但是每穗的小穗数更多,籽粒更长。与CS相比,Hy36和Hy37的株高和单株分蘖数都显著降低。使用近红外光谱仪DA7250测得有关品质的多项指标,发现Hy36在种子硬度参数上显示了较低的数值,说明中间偃麦草特异Pina基因在小麦背景中能明显降低小麦种子硬度。此外,Hy36和Hy37的籽粒蛋白质含量显著高于CS,表明中间偃麦草的优异基因资源可用于小麦品质改良。通过分子细胞遗传学分析,我们准确鉴定了两个新型小麦-中间偃麦草衍生系,揭示了小麦-中间偃麦草杂交后代中频繁存在的染色体重排事件,有助于理解中间偃麦草St、J和J~s基因组间的进化研究关系。这些新鉴定的小麦-中间偃麦草衍生系能够增加小麦遗传资源的多样性,对小麦育种研究有重要的应用价值。
【学位授予单位】：电子科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S512.1;Q78
【图文】：

绿色,红色,中间偃麦草,条染

我们构建了一个新的中间偃麦草核型图（图3-1, (e)）。探针 Oligo-pTa71 和 Oligo-5SrDNA 分别代表 18S-5.8-45S rDNA 和 5SrDNA，主要杂交信号位于 1 同源群和 5 同源群染色体上。基于这两个同源染色体臂比的差异，能够确定中间偃麦草中 1J、5J、5Js、5St 和 1St 的染色体核型图（图3-1）。3.2 中 5 和中 2 核型的精细鉴定小麦-中间偃麦草部分双二倍体中 5 拥有 56 条染色体，利用多种探针Oligo-B11、Oligo-pDb12H、Oligo-pSc119.2、Oligo-pTa535、Oligo-pTa71、Oligo-3A1和 Oligo-(GAA)7对其做进一步的细胞学分析（图 3-2, (a-e)）。由图 3-2 (a)我们能够明显地看出中 5 的 14 条外源染色体，其中有 8 条染色体具有 Oligo-pDb12H 信号。在这 8 条染色体中，有 2 条染色体长短臂上均具有 Oligo-pDb12H 信号，属于完整的 Js基因组染色体，其余 6 条染色体只有一端臂上具有 Oligo-pDb12H 信号

多探针,染色体,和中,探针

运用至少 8 个 ND-FISH 探针去鉴定中 2（2n=54）中的中间偃麦草染色体（图3-2, (f-j)）。中 2 含有 6 对中间偃麦草染色体，原位杂交核型图如图 3-2 (f)所示。一对 Js的短臂末端上有强 Oligo-pSc119.2 和 Oligo-pSt122 探针信号，这对染色体是重组的 4Js染色体[43]。一对未确定的 Js染色体被标注为 F，其余的 4 对染色体分别与中 5 的 B、C、7Js和 1St/Js染色体一致。中 2 的 B、C 染色体的 Oligo-pSt122 探针信号与中 5 的 B、C 染色体存在差异，可能是由于在不同的传递背景下染色体发生了重排。因此，中 2（2n=54）包含 42 条小麦染色体和 12 条中间偃麦草染色体，分别为 6 条 Js染色体，2 条 St 染色体，和 4 条 St-Js重组染色体（图 3-2,(j)）。图 3-2 中 5 (a-e) 和中 2 (f-j) 的多探针连续的 ND-FISH 结果。探针分别是 Oligo-B11（绿色）+ Oligo-pDb12H（红色）(a, f)

荧光原位杂交,染色体,中间偃麦草,材料

第三章结果与分析3.3 Hy36 和 Hy37 的非变性原位杂交分析利用探针 Oligo-B11 和 Oligo-pDb12H 通过 ND-FISH 鉴定小麦-中间偃麦草衍生系 Hy36 和 Hy37 处于有丝分裂中期细胞的染色体（图 3-3）。Hy36 和 Hy37 都含有 44 条染色体，都附加了一对中间偃麦草染色体，Hy36 材料中外源染色体的短臂和长臂分别杂交 Oligo-pDb12H 信号和 Oligo-B11 信号（图 3-3, (a-d)）；Hy37材料中外源染色体一条臂含有丰富的 Oligo-B11 杂交信号而另一条臂的 Oligo-B11信号集中在亚端部区域（图 3-3, (e-h)），可知 Hy36 附加了一对 Js-St 易位染色体，Hy37 附加了一对 J-St 易位染色体。与小麦 3B 染色体的长度（8.0 μm）相比较，Hy36 材料中的偃麦草染色体平均长度为 5.0 μm，Hy37 材料中的偃麦草染色体平均长度为 4.6 μm。利用探针 Oligo-pSc119.2 和 Oligo-pTa535 对 Hy36 和 Hy37 材料进行 FISH 分析，发现其附加的中间偃麦草染色体的长臂上都有弱 Oligo-pSc119.2信号，但在 Hy37 材料中能够观察到中间偃麦草染色体短臂有一个清晰的核仁区（图 3-3, (i, j)）。Oligo-5SrDNA 探针的 FISH 杂交信号位于 Hy36 和 Hy37 材料中

【参考文献】