产色素粘质沙雷氏菌的分离鉴定及含灵菌红素合成酶的载体构建

发布时间：2020-07-08 03:33

【摘要】：粘质沙雷氏菌生长过程中会产生一种次级代谢产物灵菌红素。灵菌红素具有多种的生物活性,能够抗疟疾、抗肿瘤、免疫抑制等。野生型粘质沙雷氏菌产生的灵菌红素产量少,不能满足工业化生产的需求。单优化培养基也不能使灵菌红素的产量有很大的提高。随着生物技术的发展,通过基因工程研究粘质沙雷氏菌的产灵菌红素基因,提高灵菌红素的产量是一条可行的途径。论文通过平板划线法从湖水中分离纯化得到的一株产色素菌株。用引物27F和1492R对菌株进行16S rDNA扩增。测序结果与NCBI基因库中比对分析,确定菌株的属种。然后,采用甲醇提取菌体中色素,将粗提取物进行柱层析分离、纯化,获得较纯的红色色素。采用可见光光度计,傅里叶红外光谱(FTIR),高效液相色谱与质谱联用(LC-MS)分析鉴定红色色素。论文还研究了灵菌红素基因克隆及载体的构建。根据NCBI查找到的菌株同源序列,分别设计了含酶切位点的灵菌红素合成酶引物和非编码序列的引物。对灵菌红素合成关键酶基因pigF和pigC进行扩增,并与pBM20-T载体连接,转化筛选获得克隆菌株。扩增灵菌红素基因簇前端的非编码序列,通过重叠PCR(Overlap PCR)将非编码序列同克隆基因拼接得到重组基因。将重组基因连接pBM16A-T后,转入粘质沙雷氏菌中,通过SDS-PAGE分析重组基因表达情况。论文得到以下结果:1.经过多次划线分离,获得一株产红色色素细菌。16S rDNA测序结果显示菌株与粘质沙雷氏菌具有98%的相似度。使用酸性甲醇提取得到色素粗提取物,经柱层析分离得到纯化的红色色素,确定最佳展开剂为石油醚:乙酸乙酯=4:1。薄层色谱对红色色素分析,其Rf=0.35。使用可见光光度计扫描400-700 nm波长,图谱显示色素的最大吸收峰在535 nm。使用FTIR分析红色色素,结果表明色素的主要吸收波数为3436 cm~(-1)、2860 cm~(-1)、2924 cm~(-1)和1628 cm~(-1)。使用LC-MS分析,图谱显示主要离子峰为324.5 m/z和325.5 m/z。分析结果与已知灵菌红素结构特征对比,认定红色色素为灵菌红素。据此,获得了一株产灵菌红素的粘质沙雷氏菌。2.用设计的引物分别扩增出合成酶pigF和pigC基因为1200 bp和2700 bp。将pigF和pigC基因扩增产物与pBM20-T载体连接,转化大肠杆菌DH5α,挑取连接成功的克隆子测序。测序结果与NCBI比对,结果显示pigF和pigC基因与沙雷氏菌FS14的同源性最高。用引物扩增出非编码区的coa-1基因为600 bp。经Overlap PCR,将coa-1基因部分序列与pigC和pigF基因拼接,重组为coa-pic和coa-pif基因。然后分别与pBM16A-T载体连接,转化大肠杆菌DH5α,挑取连接成功的克隆子测序。测序结果与NCBI比对,结果显示coa-1与pigC、pigF序列重组成功,构建出pBM16A-coa-pif和pBM16A-coa-pic质粒。3.构建出的质粒转入粘质沙雷氏菌中筛选出重组子S.m-pif和S.m-pic。用SDS-PAGE分析重组子的蛋白表达,电泳结果显示重组子都正确表达出蛋白质条带。通过比对细菌生长中色素吸光度变化,发现S.m-pif菌株灵菌红素产量相比野生菌株提高了6.8%而S.m-pic菌株相比野生菌株提高了17.1%。
【学位授予单位】：成都理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q78;Q93
【图文】：

e图 1-1 五种灵菌红素。a.灵菌红素，b.十一烷基灵菌红素，c.间环庚基灵菌红素，d.环烷基灵菌红素，e. 间环灵菌红素1.3.2 灵菌红素研究进展

灵菌红素合成途径1.3.2.4灵菌红素分离纯化

2.3 实验结果2.3.1 菌株的分离与鉴定菌株形态如图2-1所示。菌株在平板上呈现红色的圆形菌落。菌落中间凸起，边缘整齐，中心点呈深红色，边缘颜色稍淡，表面圆滑，在光照下有光泽，培养过程中会散发出恶臭气味。平板培养 24 小时菌斑直径即可达约 1mm，延长培养时间可见有红色色素在琼脂上扩散。在液体培养基上的培养物为深红色。经革兰氏染色剂染色后，在显微镜下观察细菌形态为杆形，细胞呈现红色为革兰氏阴性菌。图 2-1 粘质沙雷氏菌落2.3.2 16S rDNA 序列分析菌株 16S rDNA 测序结果见附录 B。将测序结果上传 NCBI 比对后，结果显示分离的菌株属沙雷氏菌属。在比对结果中随机选取 20 株菌株构建进化树如图2-2（菌种名前面为登录号）。从图 2-2 可知，菌株与 serritia mansecens JCM1239等粘质沙雷氏菌种相似度达到 98%。确定挑取到的菌株为粘质沙雷氏菌

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本文编号：2746037