高糖胁迫下产甘油假丝酵母细胞质膜抗逆应答机制的初步研究

发布时间：2020-07-10 08:08

【摘要】：产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)具有抗逆性强、糖代谢迅速、目标产物转化率高等特点,特别是在500 g·L~(-1)的高葡萄糖浓度下仍可维持很好的发酵性能,是一株可应用于节能环保浓醪发酵的渗透压工业酵母。酵母细胞质膜是其与外界环境进行物质能量交换和信号传递的重要场所,在胁迫压力下会发生一系列的动态应答,与此相关的理论机制可为指导实际生产提供重要的科学依据。本研究在建立了一种适合C.glycerinogenes质膜提取方法的基础上,对其高糖胁迫下质膜的组成和相关基因的全局转录应答机制展开研究,主要结果如下:(1)采用先制备原生质体、再低渗裂解获得粗膜提取物、最后双水相分离纯化细胞质膜的策略,优化了原生质体的制备方法和粗膜的两相分离纯化体系,得到一种适合于C.glycerinogenes的高效质膜提取方法,优化后质膜纯度平均可达65%以上。(2)研究发现,C.glycerinogenes在高浓度葡萄糖胁迫下,细胞质膜中的不饱和脂肪酸(特别是油酸)和麦角固醇的相对含量显著增加,而细胞质膜的流动性和通透性出现不同程度的降低。因此,C.glycerinogenes细胞质膜在高糖胁迫下通过增加油酸的含量来稳固细胞质膜的流动性,通过增加麦角固醇的含量来维持质膜稳态。(3)利用RNA-Seq测序技术考察高糖胁迫下C.glycerinogenes细胞质膜相关基因的全局转录应答情况,结果发现:获得了85个质膜相关差异显著表达基因,其中68个上调,17个下调;麦角固醇合成相关基因ERG6、ERG2、ERG3、ERG5、ERG4显著上调,这与麦角固醇含量增加的结果相符合;不饱和脂肪酸合成途径中大部分基因显著上调;1个葡萄糖转运蛋白基因的差异表达倍数最高(log2=9.55);糖脂合成、MAPK途径、mTOR途径的差异基因均显著上调。此外,受HOG途径调控的甘油合成关键基因GPD1没有上调,而模式菌株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)在高糖胁迫下更多依赖于胞内甘油的合成。综上说明C.glycerinogenes在高糖胁迫下更多依赖于细胞质膜和细胞生长相关基因的调控应答。(4)在RNA-Seq测序结果的基础上,利用RT-qPCR、基因过表达、异源表达和重组菌株的高糖耐受性测试等方法挖掘了6个高糖抗逆性能较好的C.glycerinogenes细胞质膜相关基因。它们分别是葡萄糖转运蛋白Cg2615(A0A1V2LT11)和Cg5001(A0A2U9R987)、推定的细胞色素P450基因Cg4756(A9YUC7)、被编码具有C-5甾醇去饱和酶活性的Cg3824(A0A099P0V3)、编码具有甘露糖基转移酶活性的Cg2914(A0A099P2M9)和推定的尿素跨膜转运蛋白Cg2071(A0A1Z8JUV2)。这6个基因均可提高S.cerevisiae的高糖耐受性,为工程菌株的改造提供了基因来源。
【学位授予单位】：陕西理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q933
【图文】：

抗逆,途径

陕西理工大学硕士学位论文主要包括高渗透压甘油（HOG，High Osmolarity G糖、甘油等相容性物质的合成、功能基因的抗逆机介导的高糖抗逆（HOG）应答途径作为细胞响应外部压力的关键途中起着主要作用[30,31]，是真核生物进化非常保守的isiae 为例，其 HOG 途径主要通过质膜中的渗透压感 Hkr1 与其它组分的组合作用[35]来激活下游组分来蛋白磷酸化并短时间内易位至细胞核，激活转录因子Skn7p、Sko1p、Msn2p 和 Msn4p 等，从而调控大规糖（高渗）胁迫的全局调控[36-38]，其作用机制的示意

示意图,细胞质膜,示意图,信号途径

4摘自 Wikimedia（作者：Lad图 1-2 细胞质膜组成的示意图Fig.1-2 Schematic diagram of plasma membrane compositio外界胁迫的信号途径，大多信号传导途径的膜受体在细胞质膜中分布，参与

原生质体,浓度,添加量,硕士学位论文

陕西理工大学硕士学位论文加 Lyticase 而不添加 Snailas 时，C. glycerin达到 85%以上；固定 Lyticase 添加量为 50 增加不显著（P>0.05），因此选择Snailas的最50 mg，逐渐增加 Lyticase 的添加量，原生格较为昂贵的Lyticase用量，选择Lyticase的Lyticase 的最佳配比为 Snailas 50 mg、Ly体得率可达 89.55 1.08%。

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