芽孢杆菌纤溶酶基因的克隆表达

发布时间：2020-07-10 02:30

【摘要】：随着人类生活节奏的加快,血栓性疾病成为了一种常见病、高危病。溶栓药物的需求量也在增加。相关研究人员在微生物源纤溶酶的多方面进行了研究,例如优化各种产酶条件,用基因工程方法改造纤溶酶基因,用一些物理与化学的方法诱变产纤溶酶菌株等等。本研究主要是对产纤溶酶菌株的筛选与鉴定,再通过基因工程的手段,使纤溶酶基因在大肠杆菌表达体系中实现分泌性的表达。本研究取得了以下的成果:1、以贵州大学微生物学实验室从酒曲、酒糟、窖泥等样品中分离的13株菌作为出发菌株,这13株菌能够产酱香味和芽孢。通过脱脂奶粉平板对13株菌株进行初筛,获得6株产蛋白酶能力较强的菌株;再利用纤维蛋白双层平板对6株菌进行复筛,获得一株纤溶酶活力为2344.23IU/mL的菌株,此菌株为GZHZ_(V-8)。2、参照《微生物学实验》(沈萍等,1999)第三版、《伯杰氏系统细菌学手册》(David R.Boone等,2001)第九版和《常见细菌鉴定手册》(东秀珠,2001)对GZHZ_(V-8)菌株进行形态特征与生理生化鉴定,并结合分子生物学鉴定方法,将此菌鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。3、在数据库查找纤溶酶基因序列,设计扩增纤溶酶基因编码区的特异性引物,扩增产物与pMD18-T克隆质粒经限制性内切酶双酶切后,连接、转化到E.coil DH5α,重组质粒序列全长为1205bp,ORF区包含1089bp,编码363个氨基酸;在线对克隆序列分析显示,克隆的纤溶酶基因序列与来自解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)的AprE(aprE)基因(NCBI登录号GU825966.1),在核酸水平上相似度为99.65%,氨基酸水平上相似度为100%;经过相关的生物信息学在线网站预测分析,是一种稳定的、亲水性的分泌型蛋白。不存在显著的跨膜区,包含两个保守结构域。蛋白分子量为36.99kDa,理论等电点(PI)为8.73,对蛋白结构预测显示,发现无规则卷曲占比36.64%,α螺旋占比28.37%,延伸链占比23.69%和β转角占比为11.29%。三维结构模型与模板3whi.1.A相似度为86.36%,具有DNA的结合区。4、使用限制性内切酶酶切目的DNA与表达空质粒,用T4 DNA Ligase enzyme连接,转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞,得到含有纤溶酶基因的表达菌株,表达菌株用1mmol/L浓度的IPTG诱导培养48h后测定纤溶酶活性,测得发酵上清液、菌体细胞破碎上清液和菌体细胞破碎沉淀的纤溶酶活力分别为613.26IU/mL、407.38IU/mL、993.12IU/mL。表达菌株在1mmol/L的IPTG诱导7小时后,表达量较高。发酵上清液具有溶解血栓的作用。
【学位授予单位】：贵州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q78;Q93
【图文】：

标准曲线,尿激酶,标准曲线,标准曲线图

注：D/d 即为初筛培养基上水解圈直径（D）/菌落直径（d），表示菌株产蛋白酶能力的大小3.1.2 尿激酶标准曲线图3.1 尿激酶标准曲线Fig. 3.1 The standard curve of urokinase concentration

标准曲线,纤维蛋白平板法,水解圈,纤溶酶

尿激酶标准曲线的制作方法，绘制尿激酶活性标准曲线x-0.2265，R2为0.9976，具有良好的线性关系（图3.1）。纤溶酶菌株的复筛维蛋白双层平板进行复筛，将初筛菌株（GZJSⅠ-12-2、GZJ2-7、GZJSⅡ-1、GZHZⅤ-8）发酵培养 96h 后，在 4℃、8000白双层平板检测 6 株菌发酵上清液的纤溶酶活力，产生明显的纤溶酶活性的测定方法，首先测量各个菌株溶解圈垂直均值，计算出每个溶解圈的面积，再根据尿激酶标准曲活力（表 3.2），从表 3.2 可知，GZHZV-8菌株纤溶酶活4.23IU/mL，因此，选择 GZHZV-8菌株作为产纤溶酶的出

菌落,粘稠度,乳白色,反光

征观察菌落在牛肉膏蛋白胨培养基平板上 30℃恒温培养 24h 厚，菌落表面光滑且会反光，湿润、粘稠度高、极不易凹陷、四周隆起、边缘乳白色、褶皱呈不规则锯齿状（菌株的鉴定

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