脂多糖广谱型核酸适配体的定向筛

发布时间：2020-07-13 00:49

【摘要】：脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)是革兰氏阴性细菌细胞膜的固有组成成分,是对宿主具有一定生物毒性的非分泌性物质,所以又称内毒素(Endotoxin)。当细菌裂解或死亡,脂多糖便释放出来,若进入血液则能引起机体发热,产生一系列的炎症反应,是败血性休克、多器官功能障碍综合症等疾病发生的主要致病因子。脂多糖污染不可避免,常见于食品及饮用水、药品及医疗产品中,对人体健康产生巨大的威胁和危害。因此,筛选特异性的脂多糖识别分子和拮抗物质一直是人们关注的重点和研究热点。核酸适配体(Aptamer)因具有亲和力高、特异性强、易于修饰、体外合成方便、不需要动物实验等特点已成为近年来生物识别分子领域的研究热点,在安全检测、疾病治疗、生物分析等方面得到了广泛的应用。本研究采用Capture-SELEX技术并加以改进,以鼠伤寒沙门氏菌脂多糖为靶标筛选获得了一条广谱型脂多糖核酸适配体,然后对其序列结构进行剪裁优化,同时结合荧光偏振、圆二色谱、等温滴定微量热以及分子模拟等技术探讨了序列结构功能,分析了核酸适配体与脂多糖的结合机制,建立了快速、均相的检测方法并进行了细胞抗炎性能试验,为今后脂多糖的快速检测及拮抗分子的开发奠定了良好的基础。具体研究内容如下:首先,基于Capture-SELEX技术建立定向策略筛选获得了广谱型脂多糖核酸适配体。根据碱基互补配对原则设计了一条互补序列作为桥接序列,将ssDNA筛选文库固定在合成的磁性纳米颗粒上,然后将筛选靶标鼠伤寒沙门氏菌脂多糖与其孵育,这样有亲和力、特异性的ssDNA从磁珠上解离下来与靶标形成游离复合物,通过磁分离获得PCR模板进行扩增、酶切制备单链后进行下一轮循环,经过前6轮的正筛、反筛富集后,引入鼠伤寒沙门氏菌等活菌作为定向筛选物质,再经过9轮的正筛、反筛和定向筛交替筛选后,进行克隆测序以及亲和力、特异性试验,最终获得了一条能识别四种细菌来源脂多糖的广谱型核酸适配体EA7,其K_d值为102±17 nM。其次,为进一步验证EA7分子的识别性能,构建了Structure-switching型核酸适配体生物传感器,实现了脂多糖的均相检测。在5’端标记FAM荧光基团的EA7序列的上游设计了一条3’端带有DABCYL猝灭基团标记的短互补序列qCS,在没有靶标脂多糖存在的情况下,核酸适配体与qCS结合,使得FAM与DABCYL相互靠近发生荧光共振能量转移,荧光被猝灭;当靶标出现后,由于特异性亲和力作用,脂多糖取代qCS与EA7结合,而使EA7结构发生转变,从而互补链qCS从EA7上解离下来,FAM与DABCYL相互远离,荧光恢复,根据荧光变化可实现LPS的均相检测。在最优条件下,对鼠伤寒沙门氏菌脂多糖、肠炎沙门氏菌脂多糖、铜绿假单胞菌脂多糖和大肠杆菌脂多糖线性范围分别为:5-250 ng/mL、0.025-10?g/mL、0.05-5?g/mL、0.1-10?g/mL,最低检测限分别为3.0 ng/mL、21.30 ng/mL、47.70 ng/mL、99.31 ng/mL,饮用水加标回收率在95.1%-105.1%之间。该方法操作简便、无需分离、灵敏可靠。第三,对脂多糖广谱型核酸适配体EA7(为便于编号,重新命名为LA80)序列结构及功能进行了剪裁优化和分析。根据核酸适配体的一级序列和二级序列结构对全长核酸适配体LA80采用两种剪裁优化策略,共获得7条剪裁序列,然后构建了荧光偏振竞争法对其进行特异性分析以及利用ITC法进行亲和性分析,最终通过优化去除了部分多余的序列,确定长27 bp的核酸适配体LA27为最佳优化核酸适配体,它不仅保留了对鼠伤寒沙门氏菌脂多糖、铜绿假单胞菌脂多糖和大肠杆菌脂多糖等3种脂多糖的结合能力,其亲和力还提高了约1倍,解离常数K_d=46.2±9.5 nM。通过分析,我们认为LA27上5’端的CC和3’端CGA形成的开环状部分可能是脂多糖结合的支撑区,而其余碱基组成的茎环结构则可能是与脂多糖发生作用的主要结合区。圆二色谱CD结果进一步表明LA27可能以嵌入的方式与脂多糖结合。第四,建立了基于氧化石墨烯(GO)增强荧光偏振信号的分析方法快速检测脂多糖,以对LA27在分析检测方面的性能进一步进行分析。利用水浴超声法制备获得的氧化石墨烯纳米片吸附核酸适配体分子探针,形成GO/aptamer复合物,荧光偏振信号迅速增强,加入脂多糖后,分子探针从GO上解离下来与其结合形成LPS/aptamer复合物,荧光偏振信号降低,从而实现了脂多糖的快速、均相检测。结果表明,在最优条件下,LA27对鼠伤寒沙门氏菌脂多糖、铜绿假单胞菌脂多糖和大肠杆菌脂多糖的检测限分别为38.7 ng/mL、88.7 ng/mL、154 ng/mL,比LA80作为分子探针的检测限分别提高了4.8、29和18倍;动力学试验结果表明该方法检测快速,可在30 min内完成检测。氯化钠注射液样品加标回收率在92%-112.5%之间。以上结果表明剪裁优化后的LA27由于序列更短、亲和力更好,使其检测效果更佳。第五,分析探讨了核酸适配体LA27的抗炎性能及其与LPS的结合位点和作用模式。以四种脂多糖分别诱导HepG2细胞使其产生炎症因子,利用ELISA法检测了空白组、LPS诱导组、LA27抑制组中TNF-?,IL-1?和IL-6等三种炎症因子的表达水平。结果发现,LA27抑制组中由鼠伤寒沙门氏菌脂多糖、铜绿假单胞菌脂多糖和大肠杆菌脂多糖三种脂多糖分别刺激的细胞中TNF-?,IL-1?和IL-6炎症因子的表达水平显著降低(p0.01),而肠炎沙门氏菌脂多糖中表达的炎症因子水平无显著性差异(p0.01)。这说明LA27具有一定的抗炎效果,且进一步验证了其对鼠伤寒沙门氏菌脂多糖、铜绿假单胞菌脂多糖和大肠杆菌脂多糖的识别能力。利用MOE2018软件模拟分析发现,在疏水作用、氢键作用以及静电作用三种力的共同作用下,LPS可能通过类脂A上的脂肪酸链与由LA27上T3、T4、T6、T16、T17、T19、T20等7个胸腺嘧啶T碱基形成的疏水性大沟区域结合,形成了稳定的类似“T”型结构的复合物,从而特异性识别。
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q78;O657.3
【图文】：

脂多糖,革兰氏阴性菌,化学结构,细胞膜

及污水处理厂、实验室等场所工作的人群，他们可能长期暴露于脂多糖污受到脂多糖侵害的几率更大。另外脂多糖又是抗菌药物的主要作用标靶[5,6]灵敏快速、操作简单、成本低廉的脂多糖检测方法和筛选脂多糖生物活性加强脂多糖的检测和控制以及对保障人们的身体健康和生命安全具有重要和价值，而近年来发展起来的核酸适配体技术为脂多糖的检测和拮抗开辟多糖多糖的化学结构糖是脂质和多糖构成的化合物，其化学组成比较复杂，一般可以将其分为类脂 A（Lipid A）、核心多糖和 O 特异侧链重复单元（图 1-1），其中类脂毒性中心[5]。不同细菌来源的脂多糖虽然其化学结构在 O 特异侧链重复单，但其核心多糖和类脂 A 部分则基本相似，结构相对保守。大多数革兰氏多糖都由庚糖、半乳糖、3-脱氧-D-甘露-辛酮糖酸（3-deoxy-D-manno-octulosdo）组成，类脂 A 则由一定数量的脂肪酸链和磷酸基团构成。

筛选技术,基本原理

图 1-2 SELEX 筛选技术基本原理图[56]Fig. 1-2 Schematic diagram of the SELEX technology[56]的多样性，通过传统的 SELEX 技术筛选获得的核酸适配体，有时候往往不理想，而且存在筛选耗时长、效率低等缺点作者们开发了很多新的筛选技术，如磁分离 SELEX 筛选技-SELEX 筛选技术（Graphene Oxide-SELEX）[57]、CE-SELlectrophoresis SELEX）、ePCR-SELEX 筛选技术（Emulsion PC

基本原理,技术,筛选技术,文库

图 1-3 Capture-SELEX 技术筛选 Cd2+基本原理图[67]ig. 1-3 Schematic diagram of the Capture-SELEX for selection of cadmium-binding apt种固定文库的筛选技术主要适用于金属离子、抗生素等小分子或无固定。相对于固定靶标分子的筛选技术，固定文库的筛选技术不需要修饰或分子的化学结构，因此保证了靶标分子的完整性，使筛选获得的核酸适标分子具有高度的亲和性和特异性。另外在实际检测应用中，待测样品天然结构且无法固定的，这样就避免了固定靶标分子的筛选技术所产生定文库的筛选技术也有其不足，即在固定文库的过程中或多或少地降低序列的多样性，这有可能导致起始固定文库中高亲和力、高特异性的核。另外通过碱基互补配对方式固定的文库可能存在着动态的解离平衡过的难度。非固定靶标或文库的筛选技术面提到 SELEX 筛选技术主要包括孵育结合、洗脱分离、PCR 扩增、单骤。实践证明洗脱分离是 SELEX 筛选技术成功与否最为关键的一步，也

【参考文献】