不同长度重叠子POP-PCR基因组步移技术建立与试剂盒设计

发布时间：2020-07-13 05:11

【摘要】：在没有必要进行全基因组测序的情况下,利用基因组步移技术获取已知序列的未知侧翼区域,是多数实验室的选择。目前已建立多种PCR基的基因组步移方法。我们前期建立了重叠子为10 bp的引物部分重叠PCR(Partially overlapping primer-based PCR,POP-PCR),用于基因组步移。POP-PCR不需要进行任何其它操作,是一种实用性强的方法。本论文在前期研究的基础上,建立了9-bp与15-bp重叠子POP-PCR;研发了12-bp重叠子POP-PCR基因组步移试剂盒,并对其可行性进行了测试。主要研究结果如下:1、设计了9-bp与15-bp重叠子POP引物组各两组,每组POP引物由三条引物构成[POP-P(用于第一轮PCR)、POP-S(用于第二轮PCR)、POP-T(用于第三轮PCR)],其3’-端具有9-或15-bp的一致序列(即重叠子)。由于重叠子较短,后一轮POP引物的3’-端重叠子仅能在较低温度下退火至与前一轮PCR产物的重叠子位点。每个POP引物组的三条引物分别与三条特异性引物配套使用,进行三轮巢式PCR反应,用于获取已知序列的侧翼区域。每轮PCR中,最初的5个高严谨循环使特异性引物与已知序列内的互补位点结合,并向未知序列方向延伸,形成一系列目标单链;在随后一个仅有的低严谨循环中,随机引物与模板发生部分退火,形成5’-端含有POP引物的单链DNA池,其中目标单链的3’-端与特异性引物完全互补,而非目标单链不存在任何引物的完美退火位点。在接下来的1个高严谨循环中,目标单链在特异性引物的引导下转变成双链(两个3’-端分别与特异性引物或POP引物完全互补),在此后的高严谨循环中,目标DNA分子被特异性引物与步移引物,按照常规特异性扩增模式进行指数扩增;非目标单链由于缺乏任何引物的完整互补位点,始终不能转变成双链DNA,因而不能扩增。利用POP-PCR对短乳杆菌NCL912的谷氨酸脱羧酶基因(gadA)位点,以及插入了潮霉素基因(hgy)的水稻基因组进行步移。结果表明,所有POP-PCR都可以获得清晰的目的片段,平均长度达1.5 kb。2、设计了12-bp重叠子POP-PCR基因组步移试剂盒。详细介绍了试剂盒的构成与操作方法,并利用阳性对照模板和人基因组模板对试剂盒进行了验证。结果表明,试剂盒能高效进行基因组步移,并具有通用性。
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q78
【图文】：

原理图,原理,引物,区域

第 1 章引言8年，Ochman等[45]与Triglia等[46]率先提出反向PCR（Inverse 组步移，用于获取已知序列的侧翼。该方法的基本原理如图内切酶对基因组 DNA 进行酶切处理，然后利用连接酶对已知序列两端的未知区域被连接在一起，在已知序列的两相反的引物，然后通过常规 PCR 可以扩增得到未知序列。引物的延伸方向是相对的，所扩增的区域为两条引物包围PCR 中，由于所设计的引物的扩增方向相反，所扩增的区域知序列，所以被称作反向 PCR。以考虑对连接后的环形 DNA 再次进行酶切，但是酶切位且介于两条引物之间，同时在不能在未知区域有该酶的酶扩增不成功。

序列,接头连接,基因组,未知序列

需要对未知序列的方向进行分析，根据酶切位点，以及已知列的方向，可以确定未知序列的上下游关系。.2.2 DNA 末端修饰法这些方法涉及基因组 DNA 的限制性内切，以及随后的末端修饰，如与双盒式 DNA（double-stranded DNA cassette）[有时也称为适配体（adapter）或接头（linker）]连接，然后利用来源于已知序列的巢式特异性引物和接头引进行 PCR 扩增[39, 47, 48]。由于特异性与扩增效率不够，往往需要进行 2 轮甚至巢式 PCR，每轮 PCR 使用前一轮 PCR 产物作为模板。如此，一方面可以加目的产物的扩增量，也能提高扩增的特异性。但由于每轮 PCR 均使用了接引物，被接头引物包围的非目的序列往往能得到有效的扩增；而且，双链 DNA可以自连，在 PCR 过程中，会消耗酶活性和 dNTP。因此，该方法仍然面临异性不高以及目的产物量可能不够的问题（图 1.2）。

示意图,示意图

T-接头PCR示意图

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