核孔膜在诱导脂质囊泡膜融合和细胞内递送的应用研究

发布时间：2020-07-22 15:13

【摘要】：核孔膜作为一种孔径均一和圆柱形孔形的微孔滤膜,已在各行业的精密过滤领域有广泛的应用,基于较小孔径核孔膜(100-300 nm)的挤出法也用于控制脂质体粒径。由此,本文将基于核孔膜的挤出法用于诱导脂质体或脂质囊泡膜融合。首先研究了挤出法能否诱导荧光标记脂质体和空白脂质体膜融合,继而研究了挤出法能否诱导荧光标记脂质体和外泌体发生膜融合。此外,基于物理性细胞内递送技术的原理和研究进展,推测较大孔径附核孔膜(7-11 μm)可用于细胞内递送。分别利用挤出法将荧光标记的右旋糖酐大分子递送至小鼠结肠癌细胞株CT26和人髓性白血病细胞株K562，并对影响递送效率的主要因素进行了初步考察,此外还对不同分子量右旋糖酐是否进入细胞核、入核途径及时机进行了研究。具体研究内容及结果如下:1)挤出法诱导脂质体膜融合制备了空白脂质体和含FRET荧光分子对的标记脂质体,通过挤出法诱导脂质体发生膜融合,动态光散射法(DLS)检测脂质体粒径,激光共聚焦(CLSM)观察脂质体膜融合现象,荧光分光光度计定量检测荧光强度变化并计算膜融合率,以冻融法作为对照;并考察了挤出次数、压力和温度等对膜融合效率的影响。结果显示,挤出法能诱导两种脂质体发生高效膜融合,这可从处理后的脂质体共聚焦照片中荧光强度的变化证实,此外对荧光强度变化的定量分析显示挤出75次时膜融合效率达27%。与冻融法相比,挤出法的膜融合效率相当,但是所制得的膜融合脂质体粒径分布更均一。此外,低挤出压力、生理温度和高挤出次数有利于促进膜融合和脂质混合。2)挤出法构建杂化外泌体从K562上清利用超速离心法提取外泌体,然后与荧光标记脂质体混合后挤出处理诱导膜融合,构建杂化外泌体,并与冻融法进行对照。利用透射电镜对外泌体和杂化外泌体进行观察和鉴定,CLSM观察荧光标记脂质体和外泌体的膜融合现象,DLS检测各种脂质囊泡粒径,利用荧光分光光度法检测荧光强度变化并计算膜融合效率。结果显示,挤出法能诱导脂质体和外泌体膜融合,从而构建杂化外泌体。透射电镜下,杂化外泌体仍然保持了外泌体典型的茶托样结构。CLSM观察证实二者发生了膜融合。与冻融法相比,挤出法(100次)的膜融合效率也即脂质稀释率稍低,但是挤出法制备的杂化外泌体具有均一的粒径,且挤出过程耗时短。3)利用挤出法将右旋糖酐递送入CT26细胞利用挤出法诱导CT26细胞变形及短暂膜穿孔而将不同分子量右旋糖酐递送入细胞内,观察了挤出对细胞贴壁生长和增殖的影响,采用流式细胞术(FACS)分析递送效率和细胞死亡率,并考察了核孔膜孔径和右旋糖酐分子量对递送效率的影响。CLSM观察了细胞内右旋糖酐的亚细胞分布,也即质核比。结果表明,挤出法处理的细胞保持了 CT26的贴壁生长和增殖能力。核孔膜孔径和右旋糖酐分子量影响了细胞内递送效率,孔径和分子量与递送效率负相关。3种不同分子量右旋糖酐在挤出处理后都能进入细胞核,进入细胞核的量与分子量呈负相关。4)利用挤出法将右旋糖酐递送入悬浮细胞K562利用挤出法诱导K562细胞变形及短暂膜穿孔而将不同分子量右旋糖酐递送入细胞内,观察了挤出对细胞生长和增殖的影响,FACS分析递送效率,并考察了核孔膜孔径和右旋糖酐分子量对递送效率的影响。CLSM观察了细胞内右旋糖酐的分布,也即质核比,以确定2 MDa右旋糖酐细胞核的途径和时机。结果表明,挤出法不影响K562细胞的生长和增殖。核孔膜孔径和递送材料分子量是影响递送效率的重要因素,孔径越小,则递送效率越高,同时孔径越小,则细胞的死亡率也越高。2 MDa右旋糖酐通过挤出诱导的核膜破裂进入细胞核,并在核膜修复后保持了质核比的稳定。总之,基于核孔膜的挤出法可用于诱导脂质囊泡的膜融合并用于构建杂化外泌体,有望成为新的外泌体修饰方法;此外,基于核孔膜的挤出法可用于递送各种大分子至贴壁细胞CT26和悬浮细胞K562,有望成为新的物理性细胞内递送方法。
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q25
【图文】：

核孔膜,滤膜

柱状损伤区域，直径约１０邋ｎｍ，这些损伤区域称作离子的潜径迹，潜径迹经过化学逡逑蚀刻处理可形成中空通道（孔），即为核孔膜［１］。相比于常规滤膜，核孔膜拥有众多逡逑优点，如表面平整光滑、孔径均一、圆柱形孔形（图１－１），此外还具有机械强度高、逡逑过滤速度快和截留特性好等优点。逡逑核孔膜的生产工艺主要包括辐照、紫外敏化和蚀刻等三个主要步骤。辐照一般逡逑利用加速器或者反应堆进行，目前主要都采用加速器进行辐照。紫外敏化主要是改逡逑善核孔膜的孔形，让锥度更小、透气率更高、孔径更均匀。化学蚀刻则决定核孔膜逡逑最终孔径大小。逡逑｜§邋廔ｉ逡逑（Ａ：核孔膜；Ｂ：普通滤膜）逡逑图１－１核孔膜与普通滤膜比较逡逑基于核孔膜的特点，其应用已相当广泛［２］。目前，很多微生物检测、癌细胞的逡逑检测以及气体的检测都需要用到核孔膜截留取样。在制药工业，核孔膜主要用于药逡逑用水的过滤及终端除菌过滤，血液制品的过滤，空气与蒸汽的过滤等。在食品饮料逡逑行业，核孔膜用于酒类、饮用水、奶制品、茶饮料等的澄清和除菌过滤，可代替离逡逑心法用于分离，或代替热处理法用于除菌。在电子工业，可用于制备光刻胶及环境逡逑气体净化

体用,细胞分泌,技术,示意图

括各种活性酶［６］。此外，外泌体还包含一系列寡核苷酸，尤其是线粒体ＤＮＡ、信使逡逑ＲＮＡ邋（ｍＲＮＡ）、微小ＲＮＡ邋（ｍｉＲＮＡ）以及许多其他非核苷酸编码ＲＮＡ序列［７］。逡逑外泌体可从所有细胞类型分泌（图１－２），用作细胞间的通讯载体，并通过各种逡逑方式与靶细胞相互作用。外泌体在炎症、稳态、凝血和钙化等正常生理过程中起着逡逑重要作用，也与各种病理过程密切相关，特别是自身免疫性疾病和癌症［８］。这导致逡逑了两个新兴研究领域的出现：将病理性外泌体作为诊断性生物标志物和治疗靶点，逡逑以及将包载各种药物或大分子的外泌体用于疾病的治疗［９］。逡逑图１－２邋细胞分泌外泌体的示意图逡逑为了将外泌体用于疾病的治疗，前提条件是利用各种技术对外泌体进行修饰，逡逑包括对外泌体膜的修饰及将各种药物或大分子包载入外泌体。下面就对外泌体的各逡逑种修饰技术分别进行介绍。逡逑１．２．１共价偶联用于修饰外泌体膜逡逑外泌体在表面改性方面比细胞有一个明显的优势，即它们不具有细胞活性。因逡逑此，可以使用不适于活细胞膜功能化的试剂和反应条件。不过，也有一些限制条件逡逑需要考虑。例如，过高的温度、压力或溶剂会导致表面蛋白质变性，同时过高或过逡逑２逡逑

末端炔,体膜,胺基,表面

泌体表面进行了连续的化学反应。首先，碳二亚胺偶联用于将含炔的４－戊炔酸连到逡逑到外泌体膜胺基上。引入反应性炔基允许与叠氮化物标记的荧光团进行第二次点击逡逑化学反应（图１－３）。胺是在生物膜上天然表达的反应性官能团，因此是直接且合理逡逑的目标。然而，这种生物偶联方式可能因改变或隐藏表面蛋白质的活性位点而损害逡逑其功能。逡逑■－豪评逡逑ｆｅ／ｔ）邋Ｌｉｐｉｄ邋Ｐｒｏｔｅｉｎ逦－５邋Ｐｒｏｉｃｉｎ邋＊邋Ａｌｋｙｎｃ逦Ｎ３邋Ａｚｉｄｅ－Ｆｌｕｏｒ邋５４５逡逑图１－３利用末端炔基修饰外泌体膜表面胺基［１（）］逡逑１．２．２代谢标记法修饰外泌体逡逑代谢标记也是一种完善的细胞功能化策略，该方法将非天然代谢物（例如氨基逡逑酸、脂质、寡核苷酸或聚糖）添加到细胞培养基来促进细胞生物合成。这些代谢物逡逑被细胞吸收并分别整合到蛋白质组、脂质组、基因组和糖类中。尽管细胞功能化策逡逑略通常仅需要修饰细胞膜上的特定组分，但是代谢标记是一种不可控的技术，可以逡逑修饰整个细胞不同亚细胞分布的各类生物分子。因此，预期外泌体和微囊泡等都会逡逑包含有代谢标记的位点，例如内体蛋白或细胞膜脂质。Ｗａｎｇ等最近使用非天然氨逡逑基酸Ｌ－叠氮基高聚丙氨酸作为甲硫氨酸替代物将叠氮基团引入黑色素瘤细胞外泌逡逑体的蛋白质组［１１］。逡逑代谢细胞标记已广泛用于赋予细胞稀有或非天然的官能团，如叠氮化物、炔烃、逡逑硫醇、甲基丙烯酰基和酮等。这些官能团具有反应活性，可以在细胞表面进行修饰，逡逑而使用生物正交化学偶联很少或几乎没有副反应。这种方法已用于药物与修饰后的逡逑细胞偶联、选择性杀伤细胞和表面凝胶化诱导等。迄今为止

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