哈维氏弧菌磷脂酶D的酶学性质及其末端肽链对酶学性质的影响研究
发布时间：2020-07-23 23:38
【摘要】：哈维氏弧菌隶属于弧菌科中的弧菌属,主要感染虾及鱼类,在海洋环境中分布范围很广,是海水中一种常见的病原菌,主要存在于自由水体、浮游动植物体表、海底沉积物中。本研究中的磷脂酶D(phospholipase D,PLD)来源于致病菌哈维氏弧菌,通过同源建模发现它具有不同于其他PLD的独特的结构—C-末端突出一段肽链,且C-末端和N-末端肽链和其催化活性相关。因此,表征哈维氏弧菌磷脂酶D(VhPLD)的酶学性质并揭示C-末端和N-末端肽链在酶活性发挥中的功能不仅有助于了解酶的结构功能关系,为磷脂酶未来分子改造和工业化应用奠定基础,同时为针对该酶进行由哈维氏弧菌导致的病害防控均具有重要指导意义。本文以磷脂酶VhPLD为研究对象,采用大肠杆菌重组表达技术获得重组表达VhPLD。在此基础上,采用磷脂酰对硝基酚(PpNP)法和单分子层技术对其酶学性质进行分析;并通过设计和构建C-末端和N-末端肽段缺失突变体,比较分析C-末端和N-末端肽缺失前后对磷脂酶VhPLD的酶学性质的影响作用。具体研究内容以及结果如下:(1)野生型VhPLD重组表达菌株的构建及酶学性质研究。首先,构建了磷脂酶VhPLD大肠杆菌重组表达菌株pET21a-VhPLD SHuffle T7,通过诱导表达并经Ni~(2+)亲和层析、G25和Q柱阴离子交换层析得到了目的蛋白。其次,以PpNP为底物测定了其最适反应条件。结果表明:VhPLD磷脂酶活性表现的最适反应温度为45℃,pH为8.0;苯对VhPLD-WT的酶活具有激活作用。最后,基于单分子层技术对其界面吸附特性进行了研究。通过定点突变的方法,设计催化活性中心组氨酸突变体(VhPLD-H157A),避免水解对吸附过程的影响。以二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸(DMPS)为底物时,最大插入压力(MIP)值最大,结果表明VhPLD-H157A对DMPS单分子层的结合能力最强;用于研究酶蛋白的四种底物(二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)和DMPS)单分子层的协同因子a均大于0,说明四种底物与酶蛋白存在正向的作用;四种底物的初始表面压力增加值(ΔΠ_0)均大于其平衡表面压力,进一步证实酶蛋白更易从水下相迁移到到界面并与磷脂结合。(2)C-末端肽链对VhPLD的酶学性质的影响研究。首先,成功构建C-末端截断的大肠杆菌重组表达菌株pET21a-VhPLD-Δ(472-483)SHuffle T7和pET21a-VhPLD-Δ(437-483)SHuffle T7,并获得较纯的目的蛋白。其次,以PpNP为底物测定了其最适反应条件。结果表明:VhPLD-Δ(472-483)的最适温度条件为50℃,VhPLD-Δ(437-483)酶活性的最适温度条件为60℃;VhPLD-Δ(472-483)和VhPLD-Δ(437-483)的最适pH均为8.0;乙酸乙酯和乙醚对C-末端截断突变体的酶活具有明显的促进作用。最后,单分子层技术实验表明:比较MIP值可知,肽链437-472的缺失对VhPLD与DMPE的界面结合有正面促进的作用;比较协同因子a可知,肽链437-472则会促进VhPLD与DMPE的结合;比较ΔΠ_0可知,表明肽链472-483和437-472的缺失均有利于其与DMPG的结合。(3)N-末端肽链对VhPLD的酶学性质的影响研究。首先,成功构建N-末端截断大肠杆菌重组表达菌株pET21a-VhPLD-Δ(25-39)SHuffle T7,并获得了较纯的目的蛋白。其次,以PpNP为底物测定了其最适反应条件。结果表明:VhPLD-Δ(25-39)的最适温度条件为45℃,VhPLD-Δ(25-39)的最适pH为8.0;正己烷对N-末端截断突变体的酶活具有促进作用。最后,单分子层技术实验表明:比较MIP值可知,N-端肽链的缺失有助于VhPLD与DMPC和DMPG的界面结合;比较协同因子a可知,N-端肽链的缺失更有利于其与DMPE的结合;比较ΔΠ_0可知,N-端肽链的缺失更有利于其与DMPC的结合。
【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q55;Q78
【图文】：
及结构研究概述究进展经在细菌、病毒、植物、真菌和哺乳动物中鉴定了 PLD，并行分类。然而，在经过若个 PLD 基因的克隆和测序后，观I-IV）[27]。保守基序 II 和 IV 包含重复的催化序列，HxKxxxHKD）。事实上，基序 I 和 II 以及 III 和 IV 之间存在显著的核物种中内部同源性和 1-HKD 基序酶的存在，又有相当多致许多 PLD 超家族酶含有两个保守的 HKD 基序[28]（图 1D 基序的组氨酸残基已被证明是负责启动磷酸二酯酶活性的功能“IYIENQFF”的高度保守序列组成。在催化的 HKD 基序已经在高等真核生物中描述了其多碱性磷脂酰肌醇 4,5-二磷管 PLD 超家族成员的 C-末端不是同源的这一事实必须是催的突变或截短时活性会受到影响[29]。
中保守的 HKD 基序以蓝色（N-末端基序）和红色（C-末端基序）突出表图 1-2 链霉菌属 PMF PLD（PDB ID：1F0I）的晶体结构[29]Fig. 1-2 Crystal structure of Streptomyces sp. PMF PLD (PDB ID:1F0I)菌 PLD 相反，由于重组酶的表达和纯化困难，缺乏真核 PLD 结构和机制在没有高等真核 PLD 的晶体结构的情况下，目前针对 PLD 机制的酶学理 PLD 的表征。化机制研究进展二酯水解通常不会在没有金属的情况下发生[41]。当它发生时，机制必须通团的亲核攻击进行，这有利于磷酸二酯键的断裂，并且通过酸催化进行质基团能够释放。该反应取决于初始亲核试剂的来源，并可以用共价磷酸在单个步骤或两个步骤中进行。数十年的生物化学[30]、结构[42]和生物物两步法机制（图 1-3），其中亲核蛋白质残基与底物的磷酸基团形成共价
图 1-3 PLD 催化 PC 水解的反应机理[43]Fig. 1-3 Reaction mechanism of PLD-catalyzed PC hydrolysis四十多年前，Yang 等人[44]和 Stanacev 等人[45]提出 PLD 催化通过两步乒乓反应机制与共价磷酸-蛋白质中间体进行。该假设基于在伯醇存在下对甘蓝 PLD 诱导的产物形成的分析。随后水解和转磷脂酰化平行进行，此过程取决于水或醇的存在。早期的研究表明，半胱氨酸残基的巯基可以作为亲核残基[44]，这是因为对氯甲基苯甲酸酯处理修饰了游离巯基并破坏了催化作用，在七个半胱氨酸残基中含有大量 PLD。在 20 世纪 90 年代，用于表征 PLD 超家族反应机制的其他研究试图鉴定可能催化磷酸二酯酶活性的亲核蛋白残基。根据 Ponting 等人[27]和 Koonin 等人[28]对 PLD 超家族成员中重复的 HKD 基序的观察结果，有人提出亲核残基可能存在于该序列中。Sung 等人提出酵母 Spo14 / PLD1 的第二个 HKD 基序中的保守丝氨酸残基是亲核试剂，该结论基于重组 Ser911Ala 突变体的研究，其突变导致催化活性显著下降[46]。然而，随后使用1-HKD 细菌酶[47]，Nuc 核酸内切酶和 2-HKD 细菌 PLD[30]，耶尔森菌鼠毒素（YMT）
【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q55;Q78
【图文】：
及结构研究概述究进展经在细菌、病毒、植物、真菌和哺乳动物中鉴定了 PLD，并行分类。然而，在经过若个 PLD 基因的克隆和测序后，观I-IV）[27]。保守基序 II 和 IV 包含重复的催化序列，HxKxxxHKD）。事实上，基序 I 和 II 以及 III 和 IV 之间存在显著的核物种中内部同源性和 1-HKD 基序酶的存在，又有相当多致许多 PLD 超家族酶含有两个保守的 HKD 基序[28]（图 1D 基序的组氨酸残基已被证明是负责启动磷酸二酯酶活性的功能“IYIENQFF”的高度保守序列组成。在催化的 HKD 基序已经在高等真核生物中描述了其多碱性磷脂酰肌醇 4,5-二磷管 PLD 超家族成员的 C-末端不是同源的这一事实必须是催的突变或截短时活性会受到影响[29]。
中保守的 HKD 基序以蓝色（N-末端基序）和红色（C-末端基序）突出表图 1-2 链霉菌属 PMF PLD（PDB ID：1F0I）的晶体结构[29]Fig. 1-2 Crystal structure of Streptomyces sp. PMF PLD (PDB ID:1F0I)菌 PLD 相反，由于重组酶的表达和纯化困难，缺乏真核 PLD 结构和机制在没有高等真核 PLD 的晶体结构的情况下，目前针对 PLD 机制的酶学理 PLD 的表征。化机制研究进展二酯水解通常不会在没有金属的情况下发生[41]。当它发生时，机制必须通团的亲核攻击进行，这有利于磷酸二酯键的断裂，并且通过酸催化进行质基团能够释放。该反应取决于初始亲核试剂的来源，并可以用共价磷酸在单个步骤或两个步骤中进行。数十年的生物化学[30]、结构[42]和生物物两步法机制（图 1-3），其中亲核蛋白质残基与底物的磷酸基团形成共价
图 1-3 PLD 催化 PC 水解的反应机理[43]Fig. 1-3 Reaction mechanism of PLD-catalyzed PC hydrolysis四十多年前，Yang 等人[44]和 Stanacev 等人[45]提出 PLD 催化通过两步乒乓反应机制与共价磷酸-蛋白质中间体进行。该假设基于在伯醇存在下对甘蓝 PLD 诱导的产物形成的分析。随后水解和转磷脂酰化平行进行，此过程取决于水或醇的存在。早期的研究表明，半胱氨酸残基的巯基可以作为亲核残基[44]，这是因为对氯甲基苯甲酸酯处理修饰了游离巯基并破坏了催化作用，在七个半胱氨酸残基中含有大量 PLD。在 20 世纪 90 年代，用于表征 PLD 超家族反应机制的其他研究试图鉴定可能催化磷酸二酯酶活性的亲核蛋白残基。根据 Ponting 等人[27]和 Koonin 等人[28]对 PLD 超家族成员中重复的 HKD 基序的观察结果，有人提出亲核残基可能存在于该序列中。Sung 等人提出酵母 Spo14 / PLD1 的第二个 HKD 基序中的保守丝氨酸残基是亲核试剂，该结论基于重组 Ser911Ala 突变体的研究，其突变导致催化活性显著下降[46]。然而，随后使用1-HKD 细菌酶[47]，Nuc 核酸内切酶和 2-HKD 细菌 PLD[30]，耶尔森菌鼠毒素（YMT）
【参考文献】
相关期刊论文 前6条
1 王秀娟;高山;王国泽;;磷脂酶D的抗逆特性及其活性检测研究[J];湖北农业科学;2014年05期
2 张红宇;万嗣宝;尹京苑;;低温贮藏中桃果实磷脂酶D活性的测定[J];食品科技;2012年05期
3 赵紫薇;杨天奎;牟英;;磷脂酶D制备及应用的研究进展[J];粮油加工;2010年07期
4 韩丽;毕阳;魏晋梅;张雯;
本文编号：2767990
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/2767990.html
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