植物首个褪黑素受体的鉴定及其在气孔关闭与抗旱胁迫中的调控机理

发布时间：2020-07-24 02:18

【摘要】：褪黑素在生物体中普遍存在。在动物中,褪黑素作为一种重要的神经激素调节昼夜节律。植物褪黑素最早于1995年被发现。二十余年来,国内外研究者在褪黑素参与植物生长发育和胁迫应答等方面开展了广泛研究,并且取得了很大的进展。然而,由于缺乏对其受体与信号转导途径的认识,植物褪黑素是否是一种新激素还存在很大争议。本研究以蚕豆和拟南芥为植物材料,利用药理学、生理学、细胞生物学、分子生物学以及遗传学等手段研究植物褪黑素的信号转导途径,鉴定了植物中首个可能的褪黑素受体(CAND2/PMTR1),并揭示了褪黑素受体CAND2/PMTR1依赖的信号转导途径在气孔关闭和干旱胁迫中的调控机理。具体研究结果如下:1.使用不同浓度的褪黑素处理蚕豆叶片下表皮条考察褪黑素对气孔开度的调控机理。研究结果表明,5-20μmol/L褪黑素显著诱导蚕豆气孔关闭和保卫细胞H_2O_2产生。在10μmol/L褪黑素处理下,外源添加过氧化氢酶(CAT,H_2O_2清除剂)或二苯基氯化碘盐(DPI,NADPH氧化酶抑制剂)抑制了褪黑素诱导的气孔关闭和H_2O_2产生,而水杨羟污酸(SHAM,细胞壁过氧化物酶)则不起到抑制作用,表明褪黑素诱导的气孔关闭依赖NADPH氧化酶介导的H_2O_2产生。异源三聚体GTP结合蛋白(G蛋白)通过调控NADPH氧化酶活性和H_2O_2产生调节植物的气孔关闭,因此本研究随后考察了G蛋白是否参与褪黑素诱导的气孔关闭和H_2O_2产生。研究结果表明,褪黑素处理下外源添加G_α抑制剂GDP-βs降低了褪黑素诱导的气孔关闭和H_2O_2产生,而G_α激活剂GTP-γs即使在没有褪黑素的情况下也可以显著诱导气孔关闭和H_2O_2产生。由此可见,G蛋白α亚基是褪黑素信号传导途径中的关键组分,褪黑素通过G蛋白α亚基调节NADPH氧化酶介导的H_2O_2产生促进气孔关闭。2.以拟南芥突变体为材料,在分子遗传层面进一步揭示褪黑素诱导气孔关闭的信号转导途径并鉴定植物首个可能的褪黑素受体。与蚕豆类似,褪黑素能够诱导拟南芥H_2O_2产生和气孔关闭,而CAT和DPI能够抑制这个过程。与Col-0相比,NADPH氧化酶突变体rbohC和rbohD/F对褪黑素诱导的气孔关闭不敏感,表明NADPH氧化酶介导的H_2O_2产生作为褪黑素的下游信号诱导植物气孔关闭。进一步研究发现,G蛋白α亚基突变体gpα1-1和gpα1-2对褪黑素诱导的H_2O_2产生和Ca~(2+)流入不敏感,说明褪黑素诱导的气孔关闭依赖G蛋白α亚基介导的H_2O_2和Ca~(2+)信号通路。由G蛋白/G蛋白偶联受体介导的信号转导途径是真核细胞接受外界信号的保守机制。由于G蛋白参与褪黑素信号调控的气孔关闭,因此推测植物中的G蛋白偶联受体可能参与褪黑素信号的识别。本研究随后分析了拟南芥cand2、cand7和gcr1-1等G蛋白偶联受体突变体对褪黑素诱导的气孔关闭的敏感性,以筛选可能的褪黑素受体。研究结果显示,外源褪黑素诱导了Col-0、cand7和gcr1-1气孔关闭。但是,cand2对褪黑素诱导的气孔关闭不敏感,褪黑素诱导的Col-0中的气孔关闭、H_2O_2产生和Ca~(2+)信号均在cand2突变体中被抑制。以上研究结果表明,CAND2参与褪黑素信号的识别,是一个可能的植物褪黑素受体。生物信息学和亚细胞定位分析结果表明,CAND2是一个可能具有七次跨膜α-螺旋结构的膜蛋白。双分子荧光互补实验结果表明CAND2能够与拟南芥中唯一的G蛋白α亚基(GPA1)特异性相互作用。GUS染色结果与荧光定量PCR显示,AtCand2在保卫细胞、子叶、芽、根等细胞和组织中广泛表达,且其表达程度受到的褪黑素水平的调节。以上研究结果表明,CAND2是一个可能的植物褪黑素受体,并被命名为植物褪黑素受体1(Phytomelatonin Receptor 1,PMTR1)。3.气孔是植物光合作用气孔交换的主要通道,也是蒸腾作用水分散失的主要途径。植物吸收的水分95%通过气孔扩散到大气中。因此,对气孔开度的调节是降低水分散失和提高水分利用效率的有效途径。为了进一步研究褪黑素受体依赖的信号途径在气孔开度和干旱胁迫中的作用机理,本研究构建了褪黑素受体PMTR1植物表达载体并获得了过表达的转基因拟南芥PMTR1-OX。研究结果表明,与Col-0相比,仅需0.1-1μmol/L褪黑素即可明显诱导PMTR1-OX气孔关闭和H_2O_2产生。且CAT或DPI均未能使PMTR1-OX中气孔开度恢复至对照组的水平。说明PMTR1-OX对褪黑素的敏感程度更高,且作用程度更强。干旱胁迫能够诱导植物内源褪黑素水平的上升,因此本研究随后考察了PMTR1在抗旱中的作用。在干旱处理14天后,PMTR1-OX的含水量约比Col-0高20%,干重是Col-0的1.2倍,而生物量的减少仅为Col-0的38%。表明与Col-0相比,PMTR1-OX表现出较强的抗旱能力。这些结果有助于理解干旱胁迫下褪黑素及其受体的调控机理,为褪黑素作为一种新的植物激素提供证据,并对其在农作物水分高效利用与抗旱胁迫等方面的应用提供理论基础。
【学位授予单位】：昆明理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q945
【图文】：

气孔,途径,信号,病原体

昆明理工大学硕士学位论文7图1.1干旱胁迫下ABA诱导的气孔关闭信号途径Fig1.1ABA-inducedstomatalclosuresignalpathwayunderdroughtstress1.1.2.6病原菌对气孔运动的调控机理植物表皮是病原体需要跨越的第一道屏障，气孔是病原体跨越这道屏障，侵入植物叶片的主要途径[46]。气孔作为植物固有系统的一部分，能够主动抵御病原体的侵入，这个过程是植物与生俱来的反应，称为固有免疫（Innateimmunity）。植物-病原体相互作用始于彼此的分子识别，植物一旦感知到细菌等病原体表面的病原体相关分子模式（Pathogen-associatedmolecularpatterns，PAMP），便会通过一系列信号级联反应关闭气孔，从而增强对病原体的抗性，这一过程称为气孔防御（StomatalDefense）[47]。在细菌侵入叶片早期，保卫细胞表面受体激酶（Flagellinsensitive2，FLS2）迅速感知细菌表面鞭毛蛋白（Flagellin22，flg22），介导质膜中的NADPH氧化酶激活，从而诱导细胞中活性氧的迸发[48]。除此之外，这种植物固有免疫系统的触发还会引起脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）诱导的NO产生、激活外流K+通道、激活钙离子依赖型蛋白激酶以及上调植物免疫相关基因表达等一系列应答，从而促使气孔关闭，以阻止细菌的侵入[49,50]。在长期演化过程中，病原体也产生了抵御植物免疫系统的策略。丁香假单胞杆菌番茄致病变种（Pseudomonassyringaepv.tomatoDC3000,PstDC3000）是一种革兰氏阴性菌，能够引起各种植物免疫反应，经常在研究植物抗病中作为模式菌。PstDC3000能够通过产生冠毒素（Coronatine，COR）来打破气孔防御，在气孔防御反应发生一段时间后，诱导气孔重新打开[51]。

模型图,信号转导,途径,G蛋白

昆明理工大学硕士学位论文9图1.2G蛋白介导的信号转导途径模型Fig1.2Gprotein-mediatedsignaltransductionpathwaymodel1.2.2植物中G蛋白及G蛋白偶联受体的种类脊椎动物中，G蛋白具有多样性。例如，人类含有23种Gα亚基，5种Gβ亚基和12种Gγ亚基。二十世纪初，人们于拟南芥、水稻、玉米、小麦等多种高等植物中均发现G蛋白的存在[56]。与脊椎动物中G蛋白的多样性相反，植物中的G蛋白种类较少。多数植物中只存在一种G蛋白α亚基，只有大豆、豌豆等少数植物中存在一种以上的G蛋白α亚基[57]。拟南芥中仅存在一种Gα亚基（GPA1），一种Gβ亚基（AGB1）和三种Gγ亚基（AGG1-AGG3）[53]。类似地，在植物中也仅鉴定了几种GPCR样蛋白，拟南芥中的GCR1具有最显著的特征[58]。尽管如此，对已知典型的G蛋白亚基及其突变体或过表达植株的研究表明，G蛋白介导的信号转导途径参与了植物生长发育的多个过程，例如种子萌发、根系发育、形态建成、节律调节、响应逆境胁迫等。

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昆明理工大学硕士学位论文14DC3000的敏感性上升[109]。ASMT是植物褪黑素合成途径中最主要的限速酶，2014年，Zuo等在苹果中克隆出ASMT基因，命名为MzASMT1（KJ123721）。ASMT存在于细胞质中，能够受干旱胁迫的诱导表达，且与苹果叶片中褪黑素的含量呈正相关。当在拟南芥中过表达该基因时，转基因拟南芥的褪黑素含量是野生型拟南芥的2~4倍，且体内活性氧含量显著降低，并提高了其对干旱胁迫的耐受性[110]。1.3.3植物褪黑素的功能图1.4植物中褪黑素的功能Fig1.4Functionofmelatonininplants1.3.3.1褪黑素促进植物根系的生长研究表明，褪黑素作为IAA类似物，能够调控根系的生长发育，且其调控作用与褪黑素浓度相关。在低浓度时（≤10μmol/L）褪黑素能够诱导羽扇豆侧根和不定根的形成与生长，而高浓度褪黑素（≥100μmol/L）则会抑制其生长[93]。同样的现象也在芥菜（BrassicajunceaL.）、金丝桃（HypericummonogynumL.）等植物中存在[111,112]，说明低浓度褪黑素促进植物根系生长发育可能广泛的存在于高等植物中。这一特征与IAA的功能相类似，且羽扇豆内源的褪黑素与IAA有类似的组织分布，二者在根系生长发育中可能起到协同调控的作用[79]。2018年，Chen等系统的研究了外源褪黑素诱导侧根生成的机制，在拟南芥中，过表达苜蓿MsSNAT基因，与野生型相比，转基因拟南芥中H2O2含量显著上升，诱导了

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