着丝粒蛋白CENP-I的结构与功能研究

发布时间：2020-07-26 20:13

【摘要】：细胞分裂过程中,姐妹染色单体的正确分离依赖于染色体动粒与纺锤体微管的稳定连接。动粒是由多种蛋白质亚基组成的大分子机器,亚基间的分子组装与调控直接影响其与微管的连接。着丝粒蛋白CENP-I是动粒组成型亚基,在其他动粒亚基的招募和组装过程中发挥重要的脚手架(scaffold)作用。敲除CENP-I会导致染色体错配和细胞周期迟滞等异常。CENP-I与CENP-H、CENP-K、CENP-M可形成较为稳定的四元复合物,构成内层动粒的核心组分。CENP-I在动粒分子的招募和组装中发挥重要作用,但其结构与功能仍有许多未知。我们首次解析了嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum中CENP-I同源蛋白的氨基端(ctCENP-I~(NT))晶体结构。ctCENP-I~(NT)由11条α-螺旋组成(α1-α11),α1-α10反向平行堆叠,形成典型的HEAT结构域。α11呈单独未配对状态,并回折包裹HEAT结构域。由于经典的HEAT结构域具有弹性变化的特点,我们通过分子动力学模拟的方法研究外力对ctCENP-I~(NT)微观结构变化的影响。结果表明,力诱导HEAT结构域构型变化促进α11从HEAT结构域上解离,提示α11可能参与维持HEAT结构域的折叠状态。晶体结构显示,α11螺旋与HEAT结构域之间存在广泛的疏水相互作用,α11螺旋的氨基酸残基Phe208、Thr215和Leu219分别与HEAT结构域的不同部位发生疏水相互作用。α11缺失后,HEAT结构域(ctCENP-I~(HEAT))在尺寸排阻层析中呈现高度聚合状态,说明α11与HEAT结构域之间的疏水相互作用能够维持HEAT结构域的稳定构象。基于一级序列的生物信息学分析显示,参与相互作用的Phe208、Thr215和Leu219在CENP-I同源蛋白中高度保守。这些位点的氨基酸突变会导致蛋白质的构象发生变化。此外,我们探究了ctCENP-I~(NT)与其他动粒亚基CENP-H/K的分子组装机制。体外pull-down结果显示,ctCENP-I~(NT)直接结合CENP-H/K,但α11缺失或关键位点氨基酸的突变会影响HEAT结构域的折叠状态,失去或降低CENP-H/K的结合能力。免疫荧光成像实验发现,α11上的关键保守氨基酸残基对CENP-I在着丝粒上的定位起着重要作用。本文研究结果首次揭示了ctCENP-I具有HEAT结构域,并发现了影响HEAT结构域构象变化的关键区域。这些工作有助于我们对CENP-I发挥脚手架蛋白作用以及动粒组装调控机制的理解。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q253
【图文】：

结构图,着丝粒,结构图,动粒

图 1.1 着丝粒结构图（A）着丝粒结构示意图。着丝粒是染色体上连接姐妹染色单体的特定区域，着丝粒招募动粒，动粒与微管连接；（B）真核生物着丝粒可分为单着丝粒和全着丝粒；（C）单着丝粒分为点着丝粒和区域着丝粒。点着丝粒含有特定 DNA 序列，参与组装单个 CENP-A 核小体。区域着丝粒通常包含大量重复的 DNA 序列，并参与组装多个 CENP-A 核小体；（D）弥散型着丝粒，可以在染色体各个位置启动动粒的装配。Figure 1.1 The eukaryotic centromere type(A) Schematic diagram of centromere structure. Centromere is a specific region on the chromosomethat links sister chromatids. Centromeres recruits kinetochore, and kinetochore is connected tomicrotubules. (B) Eukaryotic centromeres can be divided into monocentrics and holocentrics; (C)Monocentrics are divided into point centromere and regional centromere. The point centromerecontains a specific DNA sequence involved in the assembly of a single CENP-A nucleosome. Regionalcentromeres usually contain a large number of repetitive DNA sequences and are involved in theassembly of multiple CENP-A nucleosomes; (D) Holocentromeres, which can initiate assembly ofkinetochore at various locations on the chromosome.

核小体,晶体结构,着丝粒,组蛋白八聚体

华中科技大学博士学位论文着丝粒才能募集动粒，因此 CENP-A 也被认为是着丝粒的表观遗传学标志[17 20]。CENP-A 在不同物种中具有同源蛋白，如酿酒酵母中的 CSE4，裂殖酵母中的 CNP1，果蝇中的 CID，秀丽线虫中的 HCP-3 等[21-23]。CENP-A 核小体结构与经典的 H3 核小体结构相似[24,25]，组蛋白 H2A、H2B、H4 和 CENP-A 组成组蛋白八聚体，DNA 以左手方向缠绕在组蛋白八聚体周围（图 1.2 A）。CENP-A 核小体的组装依赖 HJURP（Holliday junction recognition protein）。HJURP 的 CBD（CENP-A bind domain）与CENP-A 的 CATD 结构域（centromere-targeting domain）特异性结合（图 1.2 B），促进 CENP-A 与着丝粒 DNA 的相互作用[26,27]。AB

动粒,有丝分裂,脊椎动物,结构模型

图 1.3 脊椎动物有丝分裂动粒结构模型粒包括 CCAN 和 KMN。着丝粒中 CENP-A 是募集 CCAN 的标记。CCAN 是由 CENP-CENP-T/W/S/X、CENP-H/I/K/M、CENP-N/L 和 CENP-O/P/Q/R/U 16 种蛋白质组成的复合物CAN 负责 KMN 的招募。KMN 主要由 Knl1，Mis12 和 Ndc80 三种蛋白质复合物组成，KM责连接纺锤体微管[3]。Figure 1.3 The model of the vertebrate mitotic kinetic structure[3]inetochore consists of CCAN and KMN. CENP-A in the centromere region is a marker for ecruitment of CCAN. CCAN composed of 16 subunits such as CENP-C, CENP-T/W/SENP-H/I/K/M, CENP-N/L and CENP-O/P/Q/R/U. CCAN is responsible for the recruitment of KMMN complex is mainly composed of three protein, Knl1, Mis12 and Ndc80, and it is responsible onnecting spindle microtubules[3]..2.1 内层动粒蛋白 CCAN16 种 CCAN 亚基按相互作用和功能又进一步分为五个亚组：CENP-CENP-T/W/S/X[43]，CENP-H/I/K/M[44,45]，CENP-L/N[46,47]和 CENP-O/P/U/Q/R[48]。

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