沙雷氏蛋白酶MP与其抑制剂LupI结构功能研究

发布时间：2020-08-12 21:29

【摘要】：蛋白酶(protease)是生物体内通过切断肽键从而水解蛋白质的一类酶的总称,控制着蛋白质的大小、组成、空间构象及其最终降解。生物体内的生理活动和疾病的发生与蛋白酶息息相关。沙雷氏蛋白酶属于锌金属蛋白酶M10B亚家族,其中某些种类是一些疾病的关键致病因子。专一性沙雷氏蛋白酶抑制剂在体外可靶向抑制沙雷氏蛋白酶。通过沙雷氏蛋白酶抑制剂抑制沙雷氏蛋白酶,从而减弱产沙雷氏蛋白酶的细菌病原体的活性,成为疾病治疗的新思路。本文所研究的沙雷氏蛋白酶MP和其抑制剂LupI均来源于海洋微生物Flavobacterium sp.YS-80-122,本文对该蛋白酶MP进行了原核表达,并且分别纯化了蛋白酶MP、抑制剂LupI和MP-LupI的复合物,进行结晶条件筛选和结构功能解析,研究结果分述如下:蛋白酶MP原核表达载体的构建:以全基因组DNA作为模板,用设计的带有酶切位点的引物进行PCR扩增。先构建pTOPO-MP原核克隆质粒,再用表达质粒pET22b和pTOPO-MP构建pET22b-MP原核表达质粒,转化至大肠杆菌DH5α培养。将重组子用原始引物扩增并基因测序筛选阳性重组子,表达片段约为1443 bp,与预期的MP条带大小一致。将其转化至感受态细胞BL21诱导及表达。菌液重悬破碎后的上清用SDS-PAGE凝胶电泳和酪蛋白平板检测验证。结果表明该蛋白的大小约48 kDa,与蛋白酶MP分子质量相同,同时具有蛋白酶活性,符合原始蛋白酶MP特征。MP-LupI的复合物的制备及纯化:用HisTrap HP色谱柱对蛋白酶MP进行纯化,再用HiLoad~TMM 26/600 Superdex 200 prep grade凝胶柱和HiPrep~(TM) Q-FF16/10柱对抑制剂LupI进行纯化,均达到电泳纯后,两者以等摩尔比混合,得到MP-LupI复合物,最后用HiLoad~(TM) 26/600 Superdex 200 prep grade凝胶柱对MP-LupI复合物进行纯化,可达到电泳纯,单次纯化获得约95μL蛋白含量为20 mg/mL的MP-LupI复合物样液。MP-LupI复合物的结晶条件筛选:采用悬滴蒸发扩散方法对游离LupI和MP-LupI复合物进行结晶条件筛选。LupI采用初筛的22种条件进行复筛。MP-LupI复合物在蛋白酶MP和抑制剂LupI结晶条件的基础上,对结晶溶液浓度、沉淀剂和pH做调整,结合商业结晶试剂盒在24孔板上做结晶条件初筛。LupI在0.1 M NaCl,0.1 M BIS-TRIS pH 6.5,1.5 M(NH_4)_2SO_4条件下得到晶体。MP-LupI复合物在两种条件下均获得晶体:0.1 M DL-Malic acid,pH 7.0,12%w/v PEG 3350条件,得到MP-LupI复合物的菱形晶体;0.2 M NaCl,0.1 M MES,pH6.5,10%w/v PEG 4000条件,得到MP-LupI复合物的棱形晶体。晶体的X-射线衍射结果及精修:对复筛成功的LupI晶体和本实验筛选出的MP-LupI复合物晶体进行X-射线衍射。在上海光源进行LupI晶体X-射线衍射数据收集,分辨率达1.59?,其晶胞空间为P 21 21 21,晶胞参数为a=34.04?、b=39.28?、c=62.57?、α=β=γ=90°,使用分子置换法精修至R_(work)为0.210、R_(free)为0.218;MP-LupI复合物晶体以同样方法得到了分辨率为2?的高质量衍射数据,其晶胞空间为P 1 21 1,晶胞参数为a=51.66?、b=51.85?、c=102.14?、α=γ=90°、β=97.68°,精修至R_(work)为0.184、R_(free)为0.230。LupI和MP-LupI复合物的三维结构分析:由三维结构图可知,抑制剂LupI形成一个紧凑的七股反平行β-桶,具有简单的上下拓扑结构,通过N-末端的长链结构插入MP的活性口袋直达活性中心,改变了锌离子活性中心的构象达到抑制效果。与同源抑制剂对比LupI缺少一条β-折叠,但其α-螺旋的延长替代了部分结构上的作用,使抑制剂结构稳定。通过MP-LupI复合物与蛋白酶及抑制剂的对比,可以明确抑制发生过程中重点改变的部位是锌离子活性中心及两者接触部位的loop环。抑制剂的N-末端和MP的锌离子中心发生键合,使控制酶活的Tyr226偏转,占据了蛋白酶与底物结合的位置从而达到了抑制作用。抑制剂的β-折叠3和4之间的loop环也与MP形成氢键,使抑制效果更为稳定。本文通过对MP-LupI复合物晶体的X-射线衍射,获得了MP-LupI复合物的立体结构,分析了蛋白酶与抑制剂结合前后在结构上的区别,并与同源抑制剂进行了比较。有助于从结构上深入理解沙雷氏蛋白酶与抑制剂之间的相互作用机制,确定抑制过程中的关键区域,为将来设计专一性蛋白酶抑制剂药物提供参考。
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q78
【图文】：

质结晶研究质生长原理及影响因素是相变现象，在液相或者气相中达到过饱和状态而析出晶核，构成形成晶体，分为晶核形成和晶体生长两个过程[55]。对蛋白质溶液的要求很高，蛋白含量在 10 mg/mL 以上，纯度至少此之外，沉淀剂、添加剂、pH 值，温度、压力、外加物理场及其响蛋白的结晶[56, 57]。Majeed[58]发现沉淀剂的使用可以促进生物大有序聚集，使蛋白结晶的筛选成功率提高 3.5 倍并可显著优化晶体有机沉淀剂和 PEG 三种沉淀剂在结晶过程中，会导致不同的分子也许就是沉淀剂能诱导蛋白结晶的原因[59]。质结晶方法白质结晶相图 1-1 中，横坐标表示的是沉淀剂浓度，A-D 是四种常，分别是微批量法(Microbatch)、蒸发扩散法(Vapor diffusion)、透)和自由界面扩散法(Free-interface diffusion)[60]。

上海海洋大学硕士学位论文逡逡1.6 蛋白质晶体构象研究1.6.1 晶体数据收集X-射线的波长范围约在 0.1-10 nm，晶体中原子的间隔也属于这一数量级[64]。因此，在 X-射线的衍射下，晶体中的原子会被激发出反射波，反射波可互相叠加而产生次生衍射，携带物体信息，形成一张复杂的衍射图案[65]（如图 1-2 所示）。X-射线的衍射不能直接检测出单个分子的结构，须尽可能从所有角度对晶体发射X-射线光束，收集完整的衍射图案，才能得到相对准确的蛋白三维结构。

扩增结果 M：Trans2K Plus DNA Ma result of MP length gene. M：Trans2K amplificated result of MP表达载体的构建重组质粒进行琼脂糖凝胶电泳，有结果经 NCBI 数据库 BLAST 验证重组质粒，构建路线图见图 2-2。Ndel XhoIPCR 扩增的 MP 基因NdelAmpp（5

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