PPAR-α调控fad3小鼠肌卫星细胞能量代谢机制研究

发布时间：2020-08-12 15:30

【摘要】：N-3多不饱和脂肪酸(N-3 PUFA)在糖、脂与蛋白代谢中发挥重要作用,具有缓解胰岛素抵抗、抗炎症和保护心血管等作用。为研究N-3 PUFA在肌肉组织与肌细胞能量代谢中可能的作用机制,本试验以fad3转基因小鼠为材料,分析其肌肉、肝脏与脂肪组织中N-3PUFA组成变化;利用fad3转基因肌卫星细胞与添加外源DHA的对照组肌卫星细胞,分析N-3 PUFA对三羧酸循环(TCA)关键调节酶基因表达的影响及对PPARs基因和蛋白表达的影响;利用PPAR-α激活剂或抑制剂研究对PPARs基因和蛋白表达及对TCA关键限速酶基因的影响;通过蛋白质谱、CHIP-seq等研究手段分析N-3 PUFA的作用机制。主要结果如下:(1)转基因小鼠的fad3基因呈组织特异性表达,肝脏和肌肉组织中显著表达,尤其降低了肌肉与肝脏中的短链与中链脂肪酸总量;fad3诱使N-3 PUFA含量增加,N-6 PUFA含量下降,促进N-6 PUFA转化为N-3 PUFA;(2)在fad3小鼠肌卫星细胞中,N-3 PUFA水平明显提升;(3)蛋白质谱数据显示,fad3转基因细胞和添加100ng/ml DHA的对照组细胞中的脂肪酸代谢能力增强,线粒体氧化磷酸化和三羧酸循环(TCA)相关蛋白表达明显降低;(4)定量PCR结果表明,N-3 PUFA的增加使TCA相关基因如Idh2、Ogdh、Sdha和Mdh2的表达显著降低;(5)蛋白质谱发现,N-3 PUFA影响了PPAR蛋白通路,PPAR-α基因在fad3肌卫星细胞中的表达显著升高,而PPAR-β和PPAR-γ无明显变化;PPAR-α蛋白在fad3细胞或DHA的肌卫星细胞的表达显著降低,尤其是细胞核中的表达量明显减少,而PPAR-β和PPAR-γ无明显变化;(6)添加PPAR-α抑制剂MK886,抑制了PPAR-α表达,降低了TCA关键限速酶基因如Idh2、Ogdh、Sdha和Mdha2的表达;PPAR-α激活剂WY14643,提高PPAR-α蛋白表达,促进TCA关键限速酶表达的增加;(7)CHIP-seq结果表明,胞质内增多的N-3 PUFA会抑制PAPR-α与线粒体能量代谢相关基因的DNA序列的结合。上述结果表明,fad3催化体内N-6 PUFA转化为N-3 PUFA,显著提高体内N-3 PUFA含量,胞质内增多的N-3 PUFA抑制了PPAR-α与细胞线粒体能量代谢相关基因的DNA序列的结合,影响肌卫星细胞线粒体能量代谢。
【学位授予单位】：内蒙古大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q952
【图文】：

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PPAR-α 调控 FAD3 小鼠肌卫星细胞能量代谢机制研究3. 结果fad3 转基因小鼠鉴定 DNA 鉴定鉴定结果如图 3.1 所示，PCR 产物条带较暗或者无条带的小鼠视为转基。连续繁殖 4 个月后，共得到后代 86 只，雄鼠 48 只，雌鼠 38 只；f阳性鼠有 61 只，其中雄鼠 33 只，雌鼠 28 只，雄雌约比为 1:1。结果基因的转入没有对小鼠的生殖情况产生阻碍，小鼠均可以正常生育；后雄比为 1:1，说明 fad3 基因没有对小鼠性别产生控制。

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图 3.2 转基因小鼠 Fad3 基因表达量检测Fig 3.2 The Real-Time PCR identification of Fad3 m基因小鼠的肝脏组织、肌肉组织和脂肪组织进行脂对三种组织的脂肪酸组成和比例的影响。中短链脂肪，fad3 小鼠肌肉组织中丁酸、己酸和辛酸含量都得到酸和十一酸含量下降；肝脏中不仅丁酸、己酸和辛酸月桂酸含量都呈下降趋势；脂肪组织中，丁酸与己酸含量下降结果；从脂肪酸总量看，转基因鼠的肌肉、肪酸均下降（表3.1）。短链脂肪酸含量的总体减少，验酸氧化分解，对脂肪酸的合成有抑制作用，减少生物表 3.1 肌肉、肝脏和脂肪中、短链脂肪酸分析.1 Analysis of short- and medium-chain fatty acids in m

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内蒙古大学硕士学位论文促进 N-6 PUFA 转化为 N-3 PUFA，并且提高了体内脂肪的利用率。由于肌肉是能量代谢与消耗中心，以肌肉卫星细胞为实验材料，可以在体外研究 N-3 PUFA 对细胞 TCA 循环影响的影响机制。3.2 小鼠肌卫星细胞的原代培养3.2.1 细胞形态自转基因鼠和野生型鼠肌肉分离肌肉卫星细胞进行培养，细胞呈放射性排列增殖。肌肉卫星细胞为扁平股状，呈梭形或纺锤形，少数为多角形（图 3.3）。当细胞数量达培养基面积 80%左右时，胰蛋白酶消化，传代培养。

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