大岩桐（Sinningia speciosa）SsPIN1基因的克隆与功能分析

发布时间：2020-08-13 02:39

【摘要】：输出载体PIN1(PIN-FORMED1)是生长素在植物体内从生成部位运输到作用部位的主要工具之一,与植物的生长发育尤其是叶原基的起始与排列密切相关。本研究以拟南芥、金鱼草等基因组数据为依据设计特异引物,采用同源克隆结合RACE技术从大岩桐获得SsPIN1基因cDNA全长。在此基础上,利用生物信息学手段进行了基因序列分析;采用实时荧光定量PCR技术进行了SsPIN1基因的组织表达模式分析和SsPIN1基因对不同激素处理后的响应分析;利用激光共聚焦显微镜检测了SsPIN1蛋白的亚细胞定位以及磷酸化位点突变对其极性定位的影响;并通过叶盘转化法将SsPIN1基因导入烟草SR-1获得抗性植物。主要研究结果如下:1.通过同源克隆结合RACE方法获得大岩桐SsPIN1基因cDNA全长序列1770bp。该序列编码的蛋白质包含589个氨基酸,分子量为64772.92道尔顿,等电点为8.074。系统发育分析显示,大岩桐SsPIN1蛋白与金鱼草的AmPIN1a的亲缘关系最近。进一步序列比对结果显示,SsPIN1蛋白由较为保守的羧基端和氨基端以及包含300个左右氨基酸的长亲水环(hydrophilic loop,HL)构成。亚细胞定位预测显示SsPIN1定位于质膜(plasma membrane,PM)。跨膜结构域预测显示,SsPIN1蛋白羧基端有5个跨膜结构域,氨基端有4个跨膜结构域,属于膜运输蛋白家族(IPROO4776)中植物运输载体家族(IRRO14024)。2.利用实时定量PCR对SsPIN1基因进行组织表达模式分析发现,该基因在大岩桐盛花期地上所有组织中均有表达。其中在幼叶叶柄中的表达量最高,花瓣与腋芽次之。利用外源激素NAA处理大岩桐幼苗后,SsPIN1基因的表达水平随处理时长的增加呈先上升再下降趋势;利用BA、GA等外源激素处理后,SsPIN1基因表达水平随处理时长的增加表现为上升趋势。3.利用激光共聚焦显微镜观察SsPIN1蛋白亚细胞定位表明,该蛋白定位在质膜上。进一步构建SsPIN1蛋白T228、T249、T287磷酸化位点的单点突变,双突和三突后,发现该蛋白的亚细胞定位发生了明显改变。突变后的SsPIN1蛋白定位在细胞质的趋势增加。其中,单点突变对SsPIN1的极性定位影响较小,三点突变对SsPIN1的极性定位影响最大。这表明磷酸化位点突变对SsPIN1极性定位的影响具有叠加效应。4.基于in fusion方法构建了pBI111L-SsPIN1过表达载体,通过农杆菌介导的叶盘转化法将SsPIN1基因导入烟草SR-1并进行Kan抗性筛选。抗性植株表现为生长变缓、根系发生受到抑制等相关表型。PCR检测抗性植株nptII基因均呈阳性。进一步通过实时定量PCR分析发现,SsPIN1基因在烟草抗性植株中的表达水平显著升高。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q943.2

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本文编号：2791397