赤拟谷盗四个半胱氨酸蛋白酶基因TccatB25、TccatL11、TccatL13和TcPigk的表达特性与RNAi效应

发布时间：2020-09-19 21:39

　　半胱氨酸蛋白酶是一类含有半胱氨酸残基活性中心并受巯基反应基不可逆抑制的蛋白水解酶,在病毒、真菌、原生动物植物、哺乳动物中广泛分布。除了基本的蛋白分解代谢功能外,还参与生理疾病、抗原呈递以及其他重要的生命活动的信号传递等。本研究基于前期高通量测序结果,筛选出三个潜在的多功能半胱氨酸蛋白酶CA分支C1家族组织蛋白酶基因:TccatB25、TccatL11和TccatL13。并且以赤拟谷盗为模式昆虫对组织蛋白酶基因在免疫、生殖、胚胎及胚后幼虫发育等功能及其调节机制进行初步探究。除此之外,本研究鉴定了隶属于半胱氨酸蛋白酶CD分支C13家族的编码糖基磷脂酰肌醇转酰胺酶催化亚基的基因TcPigK在昆虫生长发育中的功能,且利用RNA-seq对其下游信号转导调控网络进行进行探究,并得到以下结果:时期表达模式显示:TccatB25、TccatL11和TccatL13基因在赤拟谷盗的各个发育时期均有表达。TccatB25在晚期幼虫表达量最高。TccatL11在晚期蛹中表达量最高。而TccatL13在晚期成虫表达量最高。组织表达模式显示:TccatB25在头部表达量最高,其次为触角、肠以及血淋巴。TccatL11则在血淋巴中表达量最高,其次在头部;TccatL13只在肠中高表达。TccatB25、TccatL11和TccatL13在赤拟谷盗幼虫中被大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在不同时间点所诱导。这暗示该三个基因参与免疫过程。并且,注射dscatB25、ds-catL11、ds-catL13后,免疫信号转导通路中Rel、Jnk和Stat92E,以及下游免疫效应基因抗菌肽的mRNA表达量被显著的抑制。其中注射dscatB25后,抗菌肽Att2、Def1、Cec1的转录水平被抑制;注射ds-catL11、dscatL13后,除Att3外所有抗菌肽的转录水平都被抑制53%以上。除此之外,大肠杆菌和金黄色葡萄球菌刺激赤拟谷盗幼虫后72小时,TccatB25、TccatL11和TccatL13敲减组幼虫死亡率显著高于对照组。暗示TccatB25、TccatL11和TccatL13可能通过Rel、Jnk和Stat92E正调控抗菌肽的表达参与免疫功能。利用RNAi敲低TccatB25、TccatL11和TccatL13的表达量,胰岛素通路中FoxO、ToR、4EBP、Pi3k、Akt的mRNA水平发生不同趋势的变化。并且解剖和生殖实验显示,注射ds-catB25、ds-catL11、ds-catL13会使生殖腺发生不同程度发育畸形的表型,进而影响卵室和精巢瓣的平均宽度,抑制雌虫产卵量。除此之外,注射ds-catL11、ds-catL13还会导致部分卵不能孵化及部分卵孵化后胚后幼虫发育不良两种表型。暗示TccatB25、TccatL11和TccatL13可能通过胰岛素通路参与生殖、胚胎及胚后幼虫发育的功能。赤拟谷盗TcPigK进入号为TC009622,位于7号染色体(LG7)上。全长克隆结果显示TcPigK mRNA全长1299 bp,具有4个外显子和3个内含子。ORF(开放性阅读框)为1017bp,编码388个氨基酸。在对TcPigK蛋白的结构预测结果显示:TcPigK具有信号肽序列、肽酶C13家族结构域和两个天冬氨酰-连接的糖基化位点。进一步多序列比对显示,赤拟谷盗TcPigK蛋白不仅具有哺乳动物中半胱氨酸蛋白酶C13家族保守的半胱氨酸和组氨酸催化活性位点,并且具有洋刀豆Legumain的活性位点。时期表达显示TcPigK在各个发育时期都稳定表达;组织表达显示TcPigK在大部分器官或组织中均有表达,但脂肪体的相对表达量最高。在幼虫期系统性干扰TcPigK后,赤拟谷盗在晚期蛹会出现完全致死效应。在蛹期系统性干扰TcPigK后,赤拟谷盗在成虫期会出现严重的生殖缺陷并完全抑制产卵行为。为了明确TcPigK的作用机制,我们对对照组和TcPigK敲低组的RNA样本进行RNA高通量测序分析。在RNA-seq数据中,我们筛选到了382个差异表达基因,211个上调,171个下调。在382个差异表达基因中,一共有254个能被注释到GO条目三大功能群中的49个GO条目。在这些功能群体中,蛋白水解、几丁质代谢过程和防御反应是跟TcPigK的功能密切相关的。差异表达基因KEGG通路分析显示有7条通路为显著富集差异表达基因。这7条通路包括ABC转运、丙酮酸盐代谢、柠檬酸循环、精氨酸和脯氨酸代谢、钙离子代谢、二羧酸酯和二羧酸酯代谢和苯丙氨酸代谢。暗示TcPigK与昆虫表皮几丁质的形成与胞内各种物质与能量代谢的功能密切相关。
【学位单位】：南京师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q78
【部分图文】：

形态图,蛋白酶,形态,文献综述

第一章文献综述肽酶催化的保守活性位点：Cys25 和 His159。除织蛋白酶结构的重要的氨基酸残基：用于形成“催化的 His 位点形成咪唑环 Asn175[8, 9]。后来的分离纯化使其晶体结构的全面解析成为可能。图 1.1）：组织蛋白酶的成熟形式由 L 和 R 两个 3 个α螺旋（蓝色）；R 位于右侧，是与前链（片（红色）所形成的一种螺旋结构。而其保守的则位于结合的两个域的顶端开口处（黄色棒状标

组织蛋白酶,细胞凋亡,抑制剂,自噬

维持组织形态的功能丧失将会导致心血管等各组织细胞退行性大量扩增，进而引起腹主动脉瘤（Abdominal aortic aneurysms，AAA）和动脉粥样硬化（Atherogenesis）等人类疾病和癌细胞的扩散[12, 13]。而在小鼠弹性蛋白灌注诱导的 AAA 模型中显示，一旦 CatL、K 和 S 的功能缺失，都会使动脉壁中弹性蛋白的降解减少，进而缓解疾病的发生[14]。2、组织蛋白酶与细胞自噬。细胞自噬（Autophagy）过程是指一些功能失调的细胞器和受损蛋白被双层膜结构的自噬体（Autophagosome）包裹后，与动物溶酶体融合形成自溶酶体，利用其中的水解酶进行降解并得以循环利用。越来越多的证据表明细胞的自噬在细胞应激反应中对细胞生存和死亡的调控中起重要的作用。在特定的细胞刺激环境下，细胞自噬可以保护细胞远离细胞毒性[15, 16]。因此，细胞自噬可以维持组织稳态确保细胞在应激条件下存活[17]。细胞自噬的失调已在神经退行性疾病、心脏病、癌症和衰老等多种疾病的发病机制中得到证实[18-22]。

哺乳动物,侧枝

图 1.3 哺乳动物 GPI-APs的结构（引自[62]）物为例，GPI-APs 由 GPI 部分和特定蛋白两部分组脂质和膜外多糖部分组成，由于 GPI 具有两条的饱富集分布于细胞膜富含脂筏的区域（图 1.3）。其中心骨架： EtNP-6Man,1-2Man,1-6Man,1-4GlcN,1并且其可以通过侧枝修饰。核心多糖骨架包含 1 ine phosphate, EtNP），3个甘露糖（Mannose, Man）ine, Glc）[63]。其中，在很多 GPI-APs 中，与 EtN的 Man1 是常见的，而α1-2 连接到 Man3 侧枝上，而接到 Man1 只在某些 GPI-APs 中发现[62]。

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