草莓FaNBS13基因的克隆鉴定及功能分析

发布时间：2020-09-20 22:12

　　 核苷酸结合位点(nucleotide binding site,NBS)是一类抗病基因,在植物抗病反应过程中起重要作用。目前,已在番茄、拟南芥、马铃薯等许多植物中发现了NBS基因,但关于草莓NBS基因功能方面的研究相对较少。本研究从八倍体栽培草莓‘艳丽’中克隆出FaNBS13基因编码区序列,构建了其过表达载体及沉默载体,获得了转基因草莓植株,通过接种灰霉病菌分析了其对草莓灰霉病菌的抗性,旨在为全面揭示草莓NBS13基因的功能奠定重要基础。主要结果如下:(1)利用RT-PCR技术从八倍体栽培草莓‘艳丽’中克隆出FaNBS13基因,该基因编码区序列全长为1776 bp,编码592个氨基酸,利用DNAMAN 6.0软件,对其蛋白结构进行分析,发现主要核心结构域是LRR。亚细胞定位试验表明FaNBS13蛋白主要定位在细胞核上。(2)利用qRT-PCR方法检测了‘艳丽’草莓不同组织、器官中FaNBS13基因的相对表达量,发现FaNBS13基因主要在叶片中表达,以根为对照,老叶的表达量是根的2.3倍,随着叶片衰老表达量增加;在萼片和雄蕊中的表达量相对较高,分别是1.2和1.9倍;随着果实的成熟表达量也有显著变化,但表达量较低。(3)利用pRI101-AN和pRI101-RNAi载体,分别构建了FaNBS13基因的过表达载体及沉默载体,并通过农杆菌介导的遗传转化将它们转化到草莓中,最终得到过表达FaNBS13基因的转基因草莓株系10个,沉默NBS13基因的转基因草莓株系6个。经农杆菌介导将菌液注射到‘艳丽’草莓果实中,待果实成熟后接种灰霉病菌,通过观察发病情况和基因表达量验证分析表明FaNBS13基因能够提高草莓果实的灰霉病抗性。(4)分别用IAA、SA、MeJA、ABA四种激素对‘Ruegen’草莓组培苗进行处理,分别在0 h、12 h、24 h、48 h、72 h、96 h取样,利用qRT-PCR方法检测NBS13基因的表达量,发现在四种激素处理下NBS13的表达量均上调,且在IAA处理下的表达量相对较高。(5)选取生长状态基本一致的日本草莓品种‘幸香’和‘枥乙女’、欧美草莓品种‘甜查理’和‘图德拉’及自育草莓新品种‘艳丽’叶片,通过接种灰霉病菌后检测NBS13基因的表达发现,与未接种的叶片相比,NBS13基因的表达量均上调,且在感病后的日本品种中NBS13基因表达量的增加比欧美品种多。
【学位单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S668.4;Q943.2
【部分图文】：

结果与分析3 结果与分析克隆与结构分析隆 RNA 质量分析艳丽’草莓叶片中的总 RNA，rRNA 和 18S rRNA 的条带非常较低。将提好的 RNA 经反转cDNA 的质量，通过琼脂糖凝胶好（图 2）。

S验证图

图 4 菌落 PCR 电泳检测M：DL5000 DNAMarker；4、10、14：FaNBS13Fig.4 The electrophoretogram of PCR amplificationM: DL5000 DNAMarker; 4, 10, 14: FaNBS13

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本文编号：2823208