野大豆内生真菌YD-25的筛选鉴定及促生、抗重金属活性研究

发布时间：2020-09-21 07:45

　　植物内生真菌资源丰富,次生代谢产物种类繁多,具有促生长、提高植物抗逆性、抑制病原菌、抗癌、降解环境污染物等功效。野大豆(Glycine soja)是大豆的近源种,是一种具有很强适应能力和较强抗逆性的豆科植物。研究野大豆内生真菌多样性,探究其次生代谢产物的促生特性和发掘内生真菌自身的抗重金属特性,对丰富野大豆内生真菌资源、探究内生真菌与宿主之间的相互作用机制以及植物内生真菌的资源利用和潜在价值具有重要意义。本研究采取组织块法对野大豆内生真菌进行分离,结合形态学与分子生物学方法对分离出的菌株进行鉴定;通过水培大豆植株的方法筛选具有良好促生长效果的菌株,通过过滤、超声破碎、离心等方式获得菌株胞内胞外产物并比较两者对水培大豆幼苗的促生效果;通过单因素实验和正交实验确定菌株的最适培养基和培养条件;通过菌丝干重法测定3种重金属铜、铅、镉的不同浓度胁迫下,菌株对重金属抗性;通过研磨、离心等方式提取重金属胁迫下菌株的抗氧化酶,测定抗氧化酶活性变化。主要研究结果如下:1.野大豆内生真菌分离鉴定。从新鲜的健康野大豆植株中分离获得122株内生真菌,其中包括叶37株,茎46株,根29株,种子10株。经形态学和分子生物学鉴定共分为9个属,分别为镰刀菌属(Fusarium)、毛盘孢属(Colletotrichum)、角担菌属(Ceratobasidium sp)、枝顶孢属(Acremonium)、青霉菌属(Penicillium)、杯霉科(Discellaceae)、附球菌属(Epicoccum)、链格孢属(Alternaria Nees)和拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis)。2.具有促生效应菌株筛选。通过水培法对已分离的菌株进行筛选,其中菌株YD-25对大豆幼苗的促生效果最为明显且为非病原菌,经鉴定为黑附球菌(Epicoccum nigrum)。胞外产物可使培养4 d和6 d的大豆幼苗株高分别提高15.4%和18.1%。3.菌株培养条件优化。经单因素及正交试验表明,菌株YD-25的最适培养条件为:以马铃薯液体培养基为基础可溶性淀粉4%、酵母浸粉0.5%、KH_2PO_40.15%、MgSO_4 0.05%,pH 3.0,培养8 d。4.菌株对三种重金属抗性研究。YD-25菌株耐重金属Cu~(2+)的性能良好,当溶液中Cu~(2+)浓度达到2.5 mmol·L~(-1)时,菌体的耐性最好;当溶液中Cu~(2+)浓度达到5mmol·L~(-1)时,菌丝仍可缓慢生长。随着Cd~(2+)浓度逐渐增加,菌丝干重逐渐变小。当Cd~(2+)浓度达到7.5 mmol·L~(-1)时,菌丝生长缓慢。菌株耐重金属Pb~(2+)的性能良好,在铅浓度为3 mmol·L~(-1)时,菌体的耐性最好;在Pb~(2+)浓度为10 mmol·L~(-1)时,菌丝仍可缓慢生长。5.重金属胁迫下菌株抗氧化酶活性检测。随着Cd~(2+)浓度的增加,YD-25菌株的SOD活性随之下降,CAT活性增加;YD-25菌株的SOD活性在Pb~(2+)浓度为1mmol·L~(-1)时最小,当Pb~(2+)浓度达到3 mmol·L~(-1)时,YD-25菌株内的CAT活性最高;YD-25菌株的SOD活性在Cu~(2+)为3 mmol·L~(-1)时最大,YD-25菌株的CAT活性在Cu~(2+)为2 mmol·L~(-1)时最大。
【学位单位】：沈阳师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S565.1;Q93
【部分图文】：

菌落形态,菌属,菌落形态,链格孢属

14图 2-1 不同菌属菌落形态Fig.2-1 Colony morphology of different genus2.3.2 野大豆内生真菌分子鉴定经形态学和分子生物学鉴定共分为 9 个属，分别为镰刀菌属(Fusarium)、毛盘孢属(Colletotrichum)、角担菌属(Ceratobasidium sp)、枝顶孢属(Acremonium)、青霉菌属(Penicillium)、杯霉科(Discellaceae)、附球菌属(Epicoccum)、链格孢属

野大豆,内生真菌,大豆幼苗,发酵产物

野大豆内生真菌 YD-25 的筛选鉴定及促生、抗重金属活性研究3.3 结果与分析3.3.1 12 株野大豆内生真菌及发酵产物对大豆幼苗株高影响12 株野大豆内生真菌及发酵产物对大豆幼苗株高影响见图 3-1，其中 YD-16菌株的促生长效果最为明显，但 YD-16 菌株为链格孢属菌株，属于病原菌，考虑到实际应用会对农作物造成病害，不予研究。最终选定促生效果仅次于 YD-16的 YD-25 菌株作为供试菌株。

大豆幼苗,生长影响,菌株,产物

图 3-2 YD-25 菌株胞内外产物对大豆幼苗生长影响Fig.3-2 Effects of intracellular and extracellular products of YD-25 strain on the growth ofsoybean seedlings3.4 结论与讨论本章实验选取从野大豆中分离出的 12 株内生真菌(共 9 个属)，通过破碎菌丝的方法菌丝及其次生代谢产物作用于大豆幼苗，筛选其中促生效果最好且自身为非病原菌的菌株 YD-25 作为供试菌株。通过超声破碎、过滤离心等方法分别获得菌株 YD-25 的胞内胞外产物，通过水培法培育大豆幼苗并测量株高对菌株YD-25 的胞内胞外产物的促生长活性进行评价，其中菌株 YD-25 胞外产物在第 4天和第 6 天的促生率分别达到了 15.4%和 18.1%，说明菌株 YD-25 的次生代谢产物对大豆幼苗具有一定的促生长作用。大多数植物内生真菌及其自身代谢产物都可以直接或间接促进宿主植物生长。直接促进是植物内生真菌自身可产生 IAA 或 ACC 脱氨酶等物质，促进细胞伸长、刺激细胞加速分化，抑制植物体内产生过量乙烯，从而达到促进宿主植物[89][90]

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