内源小干扰RNA在小鼠母源mRNA降解中的功能研究

发布时间：2020-09-21 09:28

　　哺乳动物早期胚胎发育是指卵母细胞受精并发育到囊胚的整个过程,在此期间发生数个标志性关键事件,如母源因子降解、合子基因激活、卵裂球致密化、桑囊转换等。胚胎早期发育机制的深度解析对辅助生殖的发展具有至关重要的推进作用。大多数体外成熟的卵母细胞在形态学上是正常的,但在受精之后出现发育缺陷,其中母源因子降解异常就是原因之一。母源因子是指在卵母细胞发生过程中在细胞质中合成并储存的RNA和蛋白质等,对于调控早期胚胎发育是必需的,随着胚胎发育的进行,其功能逐渐被合子基因组的产物所取代,母源因子逐渐发生降解。母源因子降解主要体现为母源mRNA的降解,其主要通过母源通路和合子通路相互配合实现。前期的研究揭示了RNA结合蛋白、microRNA(miRNA)和piwi-interacting RNA(piRNA)在母源mRNA降解过程中的功能机制,而近年来越来越受关注的内源性小干扰RNA(endo-siRNA)在此事件中的功能一直没有被深入研究。Endo-siRNA在转录后水平对基因表达具有重要的负调控作用,预示着其在母源mRNA降解过程中可能具有重要功能。据此,本研究对endo-siRNA在小鼠早期胚胎中母源mRNA降解中的功能进行探究。本研究首先通过生物信息学对母源基因及对应小RNA进行筛选与鉴定,共鉴定出2730个母源基因及对应的9148条endo-siRNAs和72条miRNAs。表达模式分析发现,endo-siRNAs主要在二细胞期前高水平表达,在四细胞期显著下调,而miRNA则是在二细胞阶段才出现表达量上调,而此时大部分母源mRNA已经完成降解,而endo-siRNA主要存在于卵母细胞、一细胞和二细胞期胚胎中,其表达模式与母源mRNA表达模式存在负相关,预示着endo-siRNA在小鼠母源mRNA降解中可能具有关键作用。Endo-siRNA的形成主要依赖Dicer,实验通过在合子期注射Dicer干扰片段和抗体,对其mRNA和蛋白的表达进行敲低,检测endo-siRNA的缺失对母源mRNA降解的影响。单细胞转录组测序结果表明,Dicer敲低导致1164个基因表达水平出现异常,其中上调基因462个,其中母源基因只有71个,暗示endo-siRNA在合子通路中功能有限,可能主要通过母源通路发挥功能。随后通过RT-PCR和qPCR对筛选的母源基因Spin、Zfp277和Brip及其对应endo-siRNAs的表达进行检测,结果显示母源mRNA的表达模式确实和endo-siRNA存在负相关,进一步通过注射endo-siRNAs的模拟物和阻遏物,明确endo-siRNA在母源mRNA降解过程中发挥着重要功能,并且通过mRNA降解实验,证明endo-siRNA在转录后水平促进母源mRNA的降解。本研究对endo-siRNA的形成机制进行解析,通过序列比对发现一条lncRNA(lnc521),在endo-siRNA形成的区域与母源基因Zfp277形成互补。Lnc521特异性地在一细胞期高表达,并在细胞质中特异性表达。通过RNA干扰技术,发现lnc521敲低显著影响了Zfp277相应endo-siRNA的形成,并且通过显微注射322bp的lnc521序列,可以有效地补偿endo-siRNA的形成,并且恢复了母源基因Zfp277的降解,这表明母源基因Zfp277对应的endo-siRNA形成是lnc521依赖性的。在哺乳动物早期胚胎发育过程中,母源因子向合子转录物转换具有重要意义,在这个过程中母源因子迅速发生降解,被胚胎产生的新物质替代。本研究结果表明,endo-siRNA在转录后水平促进母源mRNA降解,为母胚转换机制研究开启新的方向。
【学位单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q344
【部分图文】：

小鼠早期胚胎

第一次卵裂时，非哺乳类动物已经完成原肠胚形成，因此哺乳动物着床前发育过程被认为是胎盘动物为了适应在陆地上生存的进化特征。图1-1 小鼠早期胚胎发育[2]。Fig. 1-1 Early mouse embryo development[2].在早期胚胎中，调控发育过程的职能在母源因子和胚胎基因组之间的转换，定义为合子基因转换（MZT），小鼠受精卵主要合子基因组激活发生在二细胞期，并且引发了基因表达水平显著变化，此过程作为合子基因组自身调控发育过程标志性事件（图 1-2）。此阶段的转换过程表现出胚胎发育各时期转录组相似性，通过微阵列分析以及 NGS 转录组分析发现一细胞期胚胎与二细胞期胚胎转录组存在明显差异，而二细胞期转录组与着床前发育后期胚胎相似，进一步验证了小鼠基因组激活的时期[3]。需要说明的是，在晚期小鼠一细胞胚胎发生次要基因组激活

母源,时空调控,因子

合成提供了丰富的原始物质。在小鼠中，卵母细胞从 GV 期到晚期一细胞胚胎过程中的转录是沉默的，在减数分裂恢复之后母源因子开始降解，近 90%的母源 mRNA 在二细胞期时已被图1-3 母源因子降解的时空调控[32]。Fig. 1-3 Temporal control of maternal factor clearance[32].降解，并且已有多项研究显示，母源因子降解过程的异常会影响整个胚胎发育进程，如合子基因组激活，因此母源因子的降解在时间和空间上受到严格调控，正常的降解对于胚胎发育是十分重要的。1.1.4 母源因子降解与腺苷酸化卵母细胞和早期胚胎是转录沉默的，因此早期发育过程完全依赖于母源因子，母源因子的早期调控过程是在细胞质中完成的，涉及 mRNA 稳定性、翻译以及 RNA 定位，并且三个方面高度相关。信使 RNA 在 5’端具有帽子结构，在 3’端具有 poly（A）尾，这两个结构对于 mRNA 的翻译和稳定性十分重要[33, 34]。其中 mRNA poly（A）长度的调控对翻译过程至关重要

序列,母源,调控机制,因子

图1-4 SMG在母源因子降解中的调控机制[32]。Fig. 1-4 Regulation mechanism of SMG in maternal factor clearance[32].子基因转换过程中母源 mRNA 降解的重要组件，约有三分之二的 mRNA 受到 SMG 的调控[71在 mRNA 降解过程中与 SMG 直接作用的 RNA 有着共同的特点，在其序列中都富含 SRESMG 的合成取决于受精卵激活诱导的级联放大反应，在受精后不久呈现瞬时的峰值，SM的时序调控对于受精卵激活之后 mRNA的降解同样起关键作用。除CCR4-NOT复合体和SM之外，piRNA 也同样是 mRNA 降解的母源机制中的一部分，在果蝇中，大部分 piRNA 是转座元件产生的，piRNA 的主要功能是通过类似于 RNA 干扰机制抑制转座元件的表达和殖系转移。PiRNA 通常与 Argonaute 蛋白结合靶向 mRNA，其在特异性 mRNA 降解上具有要的功能，在卵母细胞成熟过程中同样合成并储存了大量 piRNA，有研究表明 piRNA 可以向 Nos mRNA 3’UTR，与 AUB、AGO3、SMG 和 CCR4 形成复合体，引发 Nos mRNA 的脱苷酸化和降解[72-74]，Nos 依赖于 piRNA 的降解通路对于胚胎前后轴的建立是必需的[75]。MIW参与了非转座元件 RNA 的调控，MIWI 可以独立与 mRNA 结合，它们的相互作用使 mRN处于翻译抑制状态[76]。在非洲爪蟾中，母源 mRNA 的降解只发生在 MZT 之后[77-79]。脱腺酸化由胚胎脱腺苷酸元件（EDEN）驱动，由位于 3’UTR 中富含的 GU 序列组成，可与 EDEN-B结合，与 EDEN-BP 结合的很多 mRNA 参与卵母细胞成熟[80]，在早期胚胎中脱腺苷酸化的序调控取决于受精时 EDEN-BP 的激活（图 1-5）。

【相似文献】