菠菜SpoPTI1-3基因克隆及其高温应答功能分析
发布时间：2020-09-25 09:39
“温室效应”导致全球变暖,严重影响植物生长发育,导致作物产量降低。研究植物高温应答分子机制是目前国际上的热点问题之一。菠菜(Spinicia oleracea L.)是我国重要的绿叶蔬菜,研究其热应答分子调控机制,对利用分子标记辅助育种技术培育耐热抗病菠菜新品种具有重要意义。Pto-interacting 1(PTI1)基因编码丝氨酸/苏氨酸激酶,参与调控ROS平衡和MAPK信号通路,以及脂类代谢等多种过程,研究PTI1对高温应答调控作用将为深入解析植物高温应答分子机制提供重要信息。我们在菠菜基因组中发现4个编码PTI1蛋白的基因,其蛋白同源相似性达68.38%。我们克隆到Spo PTI1-3基因,其最大开放阅读框为1224bp,共编码407个氨基酸,理论分子质量为45.19k Da。Spo PTI1-3蛋白与多种植物的PTI1蛋白同源性都较高,且在多个不同物种间,PTI1蛋白的激酶结构域、磷酸化功能位点、半胱氨酸位点都较为保守。烟草瞬时表达结果表明Spo PTI1-3蛋白定位于细胞质和细胞核中。在菠菜六叶期不同组织器官中Spo PTI1-3基因在须根中的基因表达量最高,在第一对真叶中的基因表达量最低。在菠菜抽薹期不同组织器官中Spo PTI1-3基因在新茎中表达量最高,在老叶中表达量最低。荧光定量PCR分析表明,经37℃高温处理后,菠菜耐热材料Sp75叶片中Spo PTI1-3基因的表达量与对照组菠菜热敏感材料Sp73相比一直为下降趋势,这表明高温胁迫下Spo PTI1-3基因的表达受到抑制。但在200m M Na Cl、100m M Na2CO3,200m M Na HCO3以及200μM Cd Cl2处理下,Spo PTI1-3基因表达量均上升,这说明Spo PTI1-3响应盐胁迫及重金属胁迫。Spo PTI1-3基因的高温应答表达模式实验结果显示,37℃高温处理下,野生型酵母菌株与Spo PTI1-3过表达酵母菌株的生长皆受到抑制,但过表达酵母菌株与野生型相比对高温更加敏感,这说明高温胁迫下Spo PTI1-3基因起负调控作用。但在Spo PTI1-3基因在不同盐处理下的应答表达模式实验结果显示,在不同盐胁迫下,随着处理浓度的增加,酵母的生长状况也随之减慢,野生型与过表达酵母菌株相比对盐更加敏感。这表明Spo PTI1-3蛋白能够响应盐胁迫。酵母双杂交试验分析表明,Spo PTI1-3蛋白与Spo OXI1-1蛋白之间并无互作关系。过表达Spo PTI1-3基因后,拟南芥根长被抑制,但根毛数量明显增多,特别在突变体基因回补拟南芥表型中,此特征更为明显。并且过表达Spo PTI1-3拟南芥和基因回补拟南芥同对照组相比,抽薹期更早。这表明Spo PTI1-3蛋白与At PTI1-3蛋白相比,其功能可能更强。
【学位单位】：上海师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q943.2;S636.1
【部分图文】：
文献综述 上海师范大学硕士学位论文1.5 研究目的及意义高温会影响植物的各种生理生化过程，随着分子生物学技术的不断发展，对植物适应高温胁迫的研究从生理水平步入分子水平，研究的目的不仅在于从分子水平上解释植物响应高温胁迫的机制，而是更希望获得各种抗高温基因，用于作物育种。在本实验室前期研究发现，菠菜 PTI-1 基因和蛋白质都受到高温诱导，很可能会在高温应答过程中发挥重要作用。所以明确菠菜PTI1-3基因是否高温应答、分析菠菜 PTI1-3 基因参与何种调控的信号与代谢通路，对于深入理解菠菜高温应答分子机制，并将其应用于生产实践具有重要意义。1.6 本试验技术路线
图 3-2 可知，扩增条带大小与预期一致，将条带进行切胶回收，与克隆-5861 进行连接和转化，挑取单克隆，菌液 PCR 和双酶切验证后，送公司序，测序结果表明，如图 3-3 图，已获得 SpoPTI1-3 基因的 cDNA 序列。000bp000bp2000bp1000bpM 1 M 12000bp1000bpSpoPTI1-3 基因c-5861 载体图 3-2 SpoPTI1-3 基因全长的获得M：DL 2000 DNAMarker；（a）SpoPTI1-3 基因的扩增；（b）特异引物 PCR 筛选阳性转化子；（c）重组质粒载体的酶切产物；Fig. 3-2 Full-length sequence amplification of SpoPTI1-3 by PCR
由图 3-2 可知，扩增条带大小与预期一致，将条带进行切胶回收，与克隆载体 C-5861 进行连接和转化，挑取单克隆，菌液 PCR 和双酶切验证后，送公司进行测序，测序结果表明，如图 3-3 图，已获得 SpoPTI1-3 基因的 cDNA 序列。
本文编号：2826558
【学位单位】：上海师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q943.2;S636.1
【部分图文】：
文献综述 上海师范大学硕士学位论文1.5 研究目的及意义高温会影响植物的各种生理生化过程，随着分子生物学技术的不断发展，对植物适应高温胁迫的研究从生理水平步入分子水平，研究的目的不仅在于从分子水平上解释植物响应高温胁迫的机制，而是更希望获得各种抗高温基因，用于作物育种。在本实验室前期研究发现，菠菜 PTI-1 基因和蛋白质都受到高温诱导，很可能会在高温应答过程中发挥重要作用。所以明确菠菜PTI1-3基因是否高温应答、分析菠菜 PTI1-3 基因参与何种调控的信号与代谢通路，对于深入理解菠菜高温应答分子机制，并将其应用于生产实践具有重要意义。1.6 本试验技术路线
图 3-2 可知，扩增条带大小与预期一致，将条带进行切胶回收，与克隆-5861 进行连接和转化，挑取单克隆，菌液 PCR 和双酶切验证后，送公司序，测序结果表明，如图 3-3 图，已获得 SpoPTI1-3 基因的 cDNA 序列。000bp000bp2000bp1000bpM 1 M 12000bp1000bpSpoPTI1-3 基因c-5861 载体图 3-2 SpoPTI1-3 基因全长的获得M：DL 2000 DNAMarker；（a）SpoPTI1-3 基因的扩增；（b）特异引物 PCR 筛选阳性转化子；（c）重组质粒载体的酶切产物；Fig. 3-2 Full-length sequence amplification of SpoPTI1-3 by PCR
由图 3-2 可知，扩增条带大小与预期一致，将条带进行切胶回收，与克隆载体 C-5861 进行连接和转化，挑取单克隆，菌液 PCR 和双酶切验证后，送公司进行测序，测序结果表明，如图 3-3 图，已获得 SpoPTI1-3 基因的 cDNA 序列。
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1 董美辰;菠菜SpoPTI1-3基因克隆及其高温应答功能分析[D];上海师范大学;2019年
本文编号：2826558
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