水稻CRISPR-Cas9-UBA编辑系统构建及应用

发布时间：2020-09-24 16:44

　　成簇的规律间隔的短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)及其关联蛋白(CRISPR-associated proteins,Cas)构成的CRISPR-Cas系统是存在于大多数细菌与所有古菌中的一种后天免疫系统,通过对外来DNA的识别、整合、表达、干扰来对抗入侵的质粒或噬菌体,目前已被广泛应用于基因定向敲除、添加、激活或抑制等遗传操作中。基于Ⅱ型CRISPR系统发展起来的CRISPR-Cas9已经成为继第一代锌指核酸酶(ZFN)和第二代转录激活因子样核酸酶(TALEN)之后的第三代基因编辑系统。与ZFN和TALEN基因编辑工具相比,CRISPR-Cas9系统具有剪切高效、构建简单及成本低廉等优势,但其在编辑的过程中仍存在靶基因的编辑效率差异大,部分靶位点编辑效率低下等问题。为了提高CRISPR-Cas9系统的编辑效率,本研究对实验室前期开发的单一转录单元CRISPR-Cas9(Single transcript unit CRISPR-Cas9)植物基因组编辑系统进一步改造优化,通过将Cas9蛋白与不同泛素相关结构域(Ubiquitin Associated domain,UBA)UBA1、UBA2、UBA3分别融合,构建CRISPR-Cas9-UBA基因编辑系统。进一步选择三个水稻内源基因的不同靶位点构建CRISPR-Cas9-UBA定向编辑表达载体,利用原生质体瞬时转化体系和农杆菌介导稳定遗传转化体系分别检测其剪切活性及编辑效率,从而评价不同UBA结构域对Cas9蛋白活性及编辑效率的影响。本研究的主要内容及结果如下:1.通过对不同泛素相关结构域的比较,筛选来源拟南芥的UBA1、UBA2、UBA3结构域,进行水稻密码子的偏好优化,以本实验室CRISPR-Cas9系统的pTX172为骨架载体,构建获得三个CRISPR-Cas9-UBA基因编辑系统载体pYLJ01、pYLJ02、pYLJ03。2.选择与水稻白化、矮化、卷叶表型相关的三个内源基因OsPDS、OsDEP1、OsROC5为报告基因,以前期实验中编辑效率相对较低的OsPDS-sgRNA01、OsPDS-sgRNA02、OsDEP1-sgRNA02、OsROC5-sgRNA01四个靶位点为研究对象,基于三个CRISPR-Cas9-UBA系统pYLJ01、pYLJ02、pYLJ03及对照CRISPR-Cas9系统pTX172分别构建针对以上四个靶位点的16个定向编辑表达载体。3.通过PEG介导的水稻原生质体瞬时转化体系,对融合不同UBA结构域的Cas9蛋白的剪切活性进行了初步检测,结果显示与对照组CRISPR-Cas9相比,三个CRISPR-Cas9-UBA基因编辑系统在四个靶位点均有剪切活性,说明UBA1、UBA2、UBA3结构域对Cas9蛋白的剪切活性没有影响,可以用于进一步的基因编辑效率研究。4.进一步以OsPDS-sgRNA01和OsDEP1-sgRNA02位点为研究对象,在日本晴水稻品种中进行农杆菌介导的稳定遗传转化,对再生的转基因植株靶位点进行突变检测、表型分析及突变效率比较,用来评价CRISPR-Cas9-UBA基因编辑系统的有效性、稳定性和编辑效率差异。基于PCR-RFLP和测序的基因型分析,三个CRISPR-Cas9-UBA基因编辑系统对水稻Qg源基因的剪切位点与对照CRISPR-Cas9系统一致,大部分是双等位基因或其中一个等位基因在PAM邻近端3-4位置处1bp碱基的缺失或插入。说明融合UBA1、UBA2、UBA3结构域对Cas9蛋白的剪切作用模式没有明显的影响。对突变体植株表型分析显示:对照CRISPR-Cas9系统和三个CRISPR-Cas9-UBA基因编辑系统诱导产生的突变植株表型没有明显差异。这表明CRISPR-Cas9-UBA基因编辑系统在诱导产生突变的作用机制上与CRISPR-Cas9系统没有明显差异,可以用于基因定向编辑及突变体创制。5.与CRISPR-Cas9编辑系统对比,三个CRISPR-Cas9-UBA系统在OsPDS-sgRNA01和OsDEP1-sgRNA02两个靶位点上均能有效引导基因突变,且基因编辑效率都有显著提高。其中,融合UBA2结构域的CRISPR-Cas9-UBA2系统定向编辑效率最高。
【学位单位】：电子科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q78;S511
【部分图文】：

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图 1-1 体内基因组 DNA 修复途径示意图[8]与传统的基因突变机制相比，基因编辑技术对靶基因进行定向编辑，具有简单、可控性强，高效性等优势。基因编辑技术的发展历程，如图 1-2 所示[9979 年，Scherer 和 Davis 利用质粒将外源基因成功转入酿酒酵母的基因组中，了外源基因的正常表达，这标志着基因组编辑技术的正式形成[10]。1985 年，家利用同源重组将一段外源质粒序列插入到人染色体的 β-珠蛋白位点[11]，首哺乳动物细胞中进行基因打靶并获得成功。随后同源重组这种基因编辑技术功应用于哺乳动物、粮食作物和微生物研究，可以对目标基因或基因的部分进行删除、替代，或在细胞内存在同源序列的情况下插入外源 DNA 序列。，该方法重组频率较低，仅为 10-4-10-5。对于高等植物或动物，其效率更低实践上难以广泛应用。高等动、植物中同源重组效率低可能是由于这些细胞同源重组酶效率不高。有研究表明，转入外源的同源重组酶基因后，这些物的同源重组效率提高了一个数量级[12-14]。在同源重组基因组编辑技术兴起的同时，Kim 研究团队将人工改造锌指蛋

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第一章绪论DNA 序列进行双切口切割，从而诱导细胞发生非同源末端连接修复，造成目的基因的突变[41]，这一方法具有高精确度和高特异性，也成为了目前对 DNA 进行大片段整体敲除的通用方法。2013 年，Gennequin 等研究者利用 CRISPR-Cas9 技术对小鼠 Cnr2 基因位点进行人源化改造，证实这项技术可以用于 DNA 大片段的同源整合，将大大增强我们产生各种转基因小鼠模型的能力[42]。在此之后，该技术被广泛应用于各种模式生物的研究中[43]，利用它进行基因功能探索、潜在药物靶点验证，以及由已知遗传因素导致的疾病的治疗[44]。

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第二章材料与方法图 2-1 pTX172 载体示意图.1.2 CRISPR-Cas9-UBA 基因编辑系统骨架载体本研究筛选获取泛素相关结构域 UBA1 和 UBA2 分别来自拟南芥 RAD2族中 RAD23a（AT1G16190）蛋白的第 143 186 位氨基酸、第 323 361 位，UBA3 来自拟南芥 DDI1（AT3G13235）蛋白的第 375 411 位氨基酸[62]，A1、UBA2、UBA3 结构域在拟南芥染色体上的位置，如 2-2 示意图所示。

【参考文献】