TNRC6对哺乳动物细胞中RNA干扰和基因表达调控的影响

发布时间：2020-09-24 14:04

　　 GW182又名TNRC6A,是RNA干扰过程中的核心蛋白,其与TNRC6B和TNRC6C为同源蛋白。已有研究表明,GW182可以作为骨架蛋白与AGO2(argonaute 2)及其他RNA干扰蛋白整合在一起并形成更大的蛋白复合体。但是,一直以来,研究人员大都致力于研究AGO2在细胞内的生物学作用,而对于TNRC6A,甚至TNRC6蛋白家族在细胞中的具体作用并没有深入的研究和了解。鉴于此,本研究利用小RNA在哺乳动物细胞系中对TNRC6家族基因进行了敲低和敲除,并对其生物学活性进行了研究。本研究详细阐述了TNRC6蛋白家族在RNA干扰过程中的作用。首先利用siRNA在不同的细胞系中敲低了TNRC6蛋白的表达,并检测了其对小RNA在细胞内源基因表达调控中的不同影响,包括小RNA介导的转录水平激活、转录水平抑制、可变剪接的影响以及miRNA介导的基因沉默等。本研究发现,在这些不同的生物学过程中,只有AGO2是必不可少的,GW182/TNRC6A只参与了其中一部分生物学过程。此外,本研究利用CRISPR/Cas9技术得到了TNRC6A、TNRC6B和TNRC6AB等基因敲除细胞系,并利用蛋白质谱、RNA测序等多种手段比较鉴定了不同基因敲除细胞系中差异基因及蛋白的表达,同时利用以上几种基因敲除细胞系,较为系统的检测了TNRC6蛋白在小RNA介导生物过程中的作用。本研究主要结果如下:(1)通过siRNA成功在多个哺乳动物细胞系中敲低了TNRC6基因表达,并检测了其生物学作用。研究发现,在miRNA介导的基因表达沉默、小RNA介导的转录水平激活、转录水平抑制和可变剪接等生物过程中,TNRC6蛋白参与了siRNA介导的转录水平激活基因表达和miRNA介导的基因沉默的部分过程。与之相比,AGO2在这些小RNA介导的基因表达调控中的作用更为重要。(2)利用CRISPR/Cas9技术,成功获得TNRC6A单基因敲除细胞系,TNRC6B单基因敲除细胞系和TNRC6AB双基因敲除细胞系。在多次尝试TNRC6蛋白家族(TNRC6ABC)三基因敲除失败后,本研究发现TNRC6AB双基因敲除已经影响细胞的正常生长,因此认定TNRC6A、TNRC6B和TNRC6C中至少有一个基因是维持细胞生长所必需的。所以本研究在TNRC6AB双基因敲除的基础上再次利用siRNA敲低TNRC6C的表达,以研TNRC6家族在细胞中的功能。并且在获得敲除细胞系后,利用蛋白质谱和qRT-PCR分别在蛋白和mRNA水平对目的基因进行了检测,确定了目的基因的成功敲除。此外,本研究还通过免疫荧光对TNRC6A和AGO2在HCT116野生型和基因敲除型细胞中的表达进行了检测,进一步确定基因的成功敲除。(3)利用以上基因敲除型细胞系,本研究对TNRC6影响RNA干扰因子在细胞胞质和细胞核内分布的作用进行了验证,结果表明TNRC6蛋白只影响Dicer蛋白在细胞中的亚定位,对AGO2的分布没有直接的影响。此后检测了TNRC6在siRNA介导的胞质内mRNA的降解和细胞核内长链非编码RNA的降解中的作用,阐述了其在miRNA介导的基因沉默以及小RNA介导的转录水平激活过程中的影响。研究结果表明TNRC6并不直接作用于siRNA介导的基因沉默,却在miRNA通路中具有非常重要的作用,并且其蛋白家族之间的作用是互补的。仅缺失TNRC6A或TNRC6B并不会影响miRNA通路的正常功能,同时缺失TNRC6A和TNRC6B对其有一定的影响,当对TNRC6AB双基因敲除细胞系的TNRC6C进行敲低表达后,miR-34a在细胞中无活性,证明了TNRC6蛋白家族在miRNA通路中的重要作用。此外,只有TNRC6A参与了siRNA介导的基因转录,而TNRC6B和TNRC6C对该过程没有显著影响。(4)利用RNA-seq对不同基因敲除细胞系进行了基因差异表达分析。与野生型细胞HCT116相比,在TNRC6A~(-/-)细胞中,显著上调的基因有1447个,并且上调基因主要富集分析中主要富集在细胞分化、形态、生长及蛋白定位等信号通路上,显著下调的基因有1190个;TNRC6AB~(-/-)细胞中,有2710个基因显著性上调,有2750个显著性下调,并且大量上调基因主要富集在细胞分化、形态、生长及蛋白定位等信号通路上,下调基因主要富集在核糖体RNA、核糖体相关、线粒体相关的信号通路上;而在TNRC6B~(-/-)细胞中上调基因仅有270个,下调基因仅有156个。结果表明TNRC6B对细胞中基因表达的影响较小,而TNRC6A的作用则非常重要,但两者具有相辅相成的作用效果。综上所述,TNRC6在细胞的多个生物学过程中发挥着重要的作用。TNRC6参与了miRNA介导的基因表达沉默并且在该过程中起到决定性作用,该基因也参与了基因转录激活的部分过程。并且,本研究在多个层次对该基因以上功能进行了验证,并通过RNA测序手段进一步证明了该基因在细胞生长过程中的重要性,为后期对TNRC6基因在动物细胞水平中的作用奠定了理论基础。
【学位单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q78
【部分图文】：

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第一章文献综述第一章文献综述NRC6 蛋白家族胞胞质中，小 RNA 可以调控基因的表达翻译并控小 RNA 也可以调控基因的表达转录和可变剪接。蛋白 AGO2 (Argonaute 2)和 TNRC6A（Trinucleotid多种哺乳动物细胞的细胞核中被观察到并检测到(GNRC6A 是细胞核 RNAi 过程中的中心组织者，并ion 4)-NOT(negative on TATA-less)蛋白复合物、组互作用(Hicks et al. 2017)。

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图 1-2 GW182 在细胞中的功能(Niaz et al. 2018)Figure 1-2 Overview of the various functions of GW182 in the cell.小结NRC6 蛋白在细胞中参与了非常多且重要的生物学过程，足以证明这个。然而研究 TNRC6 蛋白的挑战在于除了小 RNA 介导的基因沉默外，如在细胞中的具体生物学作用？如何找到更多的具有类似 GW 富集区的功且在哺乳动物细胞中不同亚种的 TNRC6 蛋白也需要被单独研究。此外白如何被调控、他们的相互作用同伴以及他们在细胞中不同信号通路中是是十分重要且不容忽视的。NA干扰RNAi 简介NA 干扰（RNAi）被认为是一种通过 microRNA (miRNAs)或小干扰As）调控靶基因 mRNA 稳定性从而影响哺乳动物细胞质中蛋白转录的

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d Meister 2013)、Dicer(Bernstein et al. 2001)和 TAR RNA 结合蛋白（ et al. 2012; Takahashi et al. 2014; Wilson et al. 2013)。TNRC6 蛋白结A 复合体(Huntzinger et al. 2010)并将其导向靶基因 RNA，与此同时抑制蛋白翻译过程的转录因子对蛋白表达进行调控(Djuranovic et a一种参与前体 miRNAs 剪切成成熟的双链 miRNAs 过程的核糖核酸干扰过程中，Dicer 和 TRBP 结合双链 miRNAs 并协助引导链装载于胞胞质中 RNAi 过程具有十分重要的研究和应用价值。siRNAs 是一控制特定基因表达的重要手段，许多 siRNAs 已经被用于治疗癌症等的临床试验中(Watts et al. 2012; Yang et al. 2012)。天然的和人工s 也被证实在哺乳动物细胞胞质中能特异性干扰靶基因 RNA。有研以参与细胞核中的 RNAi 过程，并证明 AGO 和 TNRC6 蛋白等 RN细胞核中(Gagnon et al. 2014; Matsui et al. 2013; Robb et al. 2005)，这干扰因子可能在细胞核中参与 RNA 转录和可变剪切。同时也有与 AGO、 TNRC6 和 CCR4-NOT 蛋白也可以在细胞核形成有功能 et al. 2018)。

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