斑联蛋白参与的肌动蛋白调控维持软骨细胞的分化状态

发布时间：2020-10-08 23:43

　　关节软骨是滑膜关节中高度特化的结缔组织,没有神经和血管,关节软骨中唯一的软骨生成细胞即软骨细胞维持关节软骨的正常功能。研究证明,软骨细胞在生物力学的动态环境中保持软骨基质合成和降解之间的平衡。一旦这种平衡被软骨细胞受到的异常机械或生物刺激破坏,软骨组织通常会发生缺失,最终导致整个关节退化。因此,关节软骨细胞的生物力学和力生物学在关节软骨的稳态和病理学中起着至关重要的作用,并且一直受到广泛的研究。软骨细胞的生物力学特性主要取决于细胞骨架,尤其是肌动蛋白细胞骨架。肌动蛋白已经被证明可调控软骨细胞的表型、硬度、粘弹性和对机械/化学刺激的反应等一系列特征。与其他真核细胞一样,软骨细胞的肌动蛋白细胞骨架和细胞外基质(ECM)通过黏着斑连接。斑联蛋白是一种集中在黏着斑的LIM蛋白,作为应力敏感蛋白,斑联蛋白能够响应力学信号在黏着斑上移动并重新定位到肌动蛋白应力纤维。斑联蛋白含有许多活跃的结构域,包括三个参与蛋白质与蛋白质相互作用的碳末端LIM结构域、与Ena/血管舒张活化的磷酸化蛋白(VASP)家族成员相互作用的富含脯氨酸的结构域、用于在细胞核与细胞质之间转移的核输出信号。已有研究表明斑联蛋白可以启动成纤维细胞中肌动蛋白细胞骨架的重塑,能够加强气道平滑肌细胞的肌动蛋白细胞骨架。研究表明斑联蛋白可以重组细胞外分泌颗粒周围的肌动蛋白纤维,调控内皮血管性血友病因子的分泌。然而,斑联蛋白在调节软骨细胞肌动蛋白细胞骨架中的作用尚未被阐明。黏着斑蛋白可以强化细胞与细胞及细胞与基质的粘连,是一种肌动蛋白结合蛋白,也是基于整合素与基于钙粘蛋白的粘附复合物的组成成分,分别通过与踝蛋白与ɑ-粘连蛋白的相互作用对力学信号快速响应并被招募到这两种类型的黏着斑。黏着斑蛋白能够形成肌动蛋白细胞骨架与黏着斑的极化连接,在维持组织完整性中起重要作用,对于持续性的细胞定向迁移也是必需的。研究表明,黏着斑蛋白和斑联蛋白共定位于黏着斑。因此,黏着斑蛋白可能会参与肌动蛋白和斑联蛋白之间的相互作用。本研究中,我们通过构建兔斑联蛋白低表达关节软骨细胞模型研究斑联蛋白对肌动蛋白细胞骨架和黏着斑蛋白的调节作用,并进行了免疫荧光、定量即时聚合酶链锁反应(qRT-PCR)和蛋白质免疫印迹来检测软骨细胞肌动蛋白和黏着斑蛋白表达及胶原蛋白合成的变化。结果显示:软骨细胞斑联蛋白的低表达增加球状肌动蛋白(G-actin)与丝状肌动蛋白(F-actin)的比值,并抑制了黏着斑蛋白、软骨形成标记物II型胶原蛋白以及肥大标记物X型胶原蛋白的表达。转化生长因子β1(TGF-β1)已被证明通过Ras同源基因家族成员A(RhoA)途径调节软骨细胞的肌动蛋白细胞骨架,所以为研究肌动蛋白对斑联蛋白和黏着斑蛋白的作用,我们采用TGF-β1处理软骨细胞并检测斑联蛋白和黏着斑蛋白的变化。结果显示:经TGF-β1处理后,软骨细胞丝状肌动蛋白的表达增强,斑联蛋白的表达减弱。同时,因TGF-β1处理后软骨细胞肌动蛋白发生聚合,导致黏着斑蛋白和去分化标记物I型胶原蛋白的表达增强,而II型胶原蛋白和蛋白聚糖的表达减弱。这些结果显示:在软骨细胞中,斑联蛋白的表达水平与肌动蛋白的聚合状态密切相关,并且斑联蛋白和丝状肌动蛋白的变化分别与II型胶原蛋白和黏着斑蛋白的变化保持一致,表明斑联蛋白与肌动蛋白的相互作用在胶原细胞外基质的合成和细胞骨架与细胞外基质的粘附重塑中起重要作用。
【学位单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q418
【部分图文】：

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第一章 4 实验结果4 实验结果染软骨细胞以敲低斑联蛋白基因的染软骨细胞后用 qRT-PCR 验证斑联蛋白基的干扰 RNA 对照（NC）和斑联蛋白干扰软骨细胞后用 qRT-PCR 反应检测了斑联向沉默信号的干扰 RNA 对照（NC）的 #627、#1009 和#1448 的软骨细胞中斑联%、43.68±4.5%和 47.13±11.4%。在这些斑 RNA 基因敲低的效果最佳，被用于后续

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沉默信号的干扰 RNA 对照（NC）和斑联蛋白干扰 RNA #1荧光图。绿色荧光表示斑联蛋白，蓝色荧光表示细胞核。沉默信号的干扰 RNA 对照（NC）与斑联蛋白干扰 R蛋白质免疫印迹检测斑联蛋白的表达默信号的干扰 RNA 对照（NC）与斑联蛋白干扰 RN胞后用蛋白质免疫印迹检测斑联蛋白的表达。结果显的干扰 RNA 对照（NC）的软骨细胞相比，转染斑联胞中斑联蛋白的表达量下降到 63.98±8.38%。

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的干扰 RNA 对照（NC）和斑联蛋白干扰，*表示 P 值小于 0.05。基因后软骨细胞丝状肌动蛋白的的干扰 RNA 对照（NC）与斑联蛋疫荧光染色与细胞骨架鬼笔环肽染干扰 RNA 对照（NC）和斑联蛋白斑联蛋白免疫荧光染色与细胞骨架色结果显示：与转染非靶向沉默信号斑联蛋白干扰 RNA#1009 的软骨细的荧光较弱。

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