苏云金芽胞杆菌以色列亚种生产菌株Bt-59的sigK突变研究

发布时间：2020-10-09 03:42

　　苏云金芽胞杆菌以色列亚种(Bacillus thuringiensis var.israelensis,Bti)是用于防治蚊、蚋等病媒生物的重要生物因子,但实际应用中存在毒力水平不够高、持效期短等问题。Sigma K(σK)因子在芽胞杆菌中能够控制芽胞形成、母细胞裂解等,同时通过Sigma(σ)因子间的级联调控,影响杀虫蛋白的形成。本文通过构建缺失σK因子的Bti突变菌株,研究了 sigK缺失对Bti生产菌株Bt-59的影响,为构建高毒力活性、持效期长的工程菌提供参考。主要研究结果如下:(1)构建了 Bt-59的sigK缺失突变菌株Bt59(△sigK):通过对Bt-59菌株全基因组测序分析,确定sigK基因的位于Genomel 05261,大小为714bp,编码237个氨基酸,与已报道的其他Bt亚种相似性均为100%。通过扩增sigK基因同源臂构建敲除载体pMADAsigK,电击转化Bt-59感受态菌株,筛选获得同源重组缺失sigK突变株Bt59(△sigK);克隆包含sigK基因及其启动子区域的1495 bp的片段PsigK-sigK,利用pHT315表达载体连接PsigK-sigK,转化突变株Bt59(△sigK)中构建获得sigK的恢复菌株 Bt59(HFsigK)。(2)明确了sig 突变对Bt-59菌株芽胞形成的作用:Bt59(△sigK)的营养期生长与原菌株Bt-59无明显差异,但培养后期观察不到芽胞的形成;而sigK基因恢复菌株Bt59(HFsigK)恢复了芽胞的形成,其总细胞数和芽胞数分别为4.64×107 CFU/mL 和 3.33×106 CFU/mL,与原菌株 2.43×106 CFU/mL 芽胞量相当,说明 sigK基因的缺失导致Bt-59菌株失去形成芽胞的能力。sigK缺失同时影响到Bti母细胞的裂解,使母细胞完全裂解时间从T25延长到T60,而Bt59(HFsigK)则又使细胞裂解速度恢复到原菌株水平。(3)分析了sig 突变对Bt-59杀虫蛋白形成和杀虫活性的影响Bt59(△sigX)培养后期能正常形成杀虫晶体蛋白,晶体形态及其大小未发生明显变化。SDS-PAGE检测结果表明,sigK突变影响了 Bt-59菌株中不同杀虫蛋白的表达量,Bt59(△sigK)中Cry4Aa/4Ba蛋白表达量提高了约1.67倍,Cyt1Aa蛋白提高了约1.21倍,而Cry1 1Aa蛋白的表达量无明显差异。生测结果表明,Bt59(△sigK)对淡色库蚊(Culexpipienspallens)的杀虫活性略微降低,而对白纹伊蚊(Aedesalbopictus)的杀虫活性则无明显影响。(4)sigK突变对Bt-59水解酶CwlC的影响:克隆并原核表达了 Bt-59菌株732 bp的cwlC片段,细胞壁裂解试验表明CwlC具有水解细胞壁活性。通过扩增617 bp cwlC启动子区域(PBcwIC)连接pHT304-18Z得到重组载体pHTPBcwlC,电击转化Bt59(△sigK)菌株中构建了 BcwlC-lacZ表达菌株Bt59(△sigK)(PBcwlc-lacZ)。lacZ活性测定发现在Bt59(△sigK)中没有转录活性,表明Bt-59 cwlC基因受sigK基因的控制。通过比较Bt库斯塔克亚种HD73母细胞裂解基因,Bt-59 CwlC能够恢复HD(△cwlC)的表型,说明Bt-59 CwlC具有水解功能。
【学位单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q78
【部分图文】：

芽胞,晶体,菌株

１．１苏云金芽胞杆菌（Ｂｔ）逡逑苏云金芽胞杆菌（５ａｃ／／／ｉ？lMＢｔ）是一种特异且安全的微生物杀虫剂，在逡逑形成芽胞时可产生一种或多种对相应昆虫具有杀虫作用的晶体蛋白（ＩＣＰｓ）（图１－１）邋Ｗ。逡逑大多数Ｂｔ菌株包含一种晶体，例如库斯塔克亚种ＨＤ７３菌株只包含一种菱形晶体（图１－１）逡逑［２】；还发现少数菌株包含多个晶体，例如以色列亚种Ｂｔｉ菌株含有至少四种晶体（图１－２）逡逑晶体的着色能力与细胞类似，易与芽胞分开识别［４，５］。目前Ｂｔ菌株主要研宄的杀虫蛋逡逑白包括Ｃｒｙ／Ｃｙｔ晶体蛋白和Ｖｉｐ分泌蛋白Tj而对Ｓｉｐ分泌蛋白的报道极少逡逑＊逡逑ＣｒｙｌｌＡ．＿＿．ｍｍ逦Ｗ＊逡逑图１－１芽胞和晶体（左图ＨＤ７３［２】，右图Ｂｔｉ【３】）逡逑Ｆｉｇ．邋１．１邋Ｓｐｏｒｅ邋ａｎｄ邋ｃｒｙｓｔａｌ邋ｏｆ邋Ｂｔｉ邋（ＨＤ７３【２】邋ｏｎ邋ｌｅｆｔ邋ａｎｄ邋Ｂｔｉ［３］邋ｏｎ邋ｒｉｇｈｔ）逡逑我国从１９５５年首次对Ｂｔ进行正式报道［９］，至今己６０多年；从收集资源、鉴定菌种等逡逑初期研宄，到如今分子生物学、转录组学和代谢组学等多技术协同应用，不断有新的未知逡逑基因被发现，新的成果层出不穷。截止２０１７年，根据一类有效成分分型，我国己经归类逡逑登记的Ｂｔ类农药产品包括２２６种

质粒,图谱,蛋白,菌株

逦［２５］、Ｂｔ莫里逊（ｗｏｒｒ＾ｏｗ／）亚逡逑种以及杰加西坦（火ｇ如心似《）亚种等菌株［２６］，也被广泛研宄。Ｂｔｉ具有传统Ｂｔ菌株的一般逡逑特点，并可以产生多种晶体蛋白，至少包括四种主效蛋白和２种次要蛋白（图１－３）【２７］；逡逑而蚊虫对Ｂｔｉ不易产生抗性则主要归因于其主效蛋白之间的不同作用模式和协同作用［２８】。逡逑１．２．２邋Ｂｔｉ杀虫蛋白逡逑Ｂｔｉ邋菌株形成的主要蛋白为邋Ｃｉｙ４Ａａ邋（ｐＢｔｌｌＯ）、Ｃｒｙ４Ｂａ邋（ｐＢｔ０３８）、ＣｒｙｌｌＡａ邋（ｐＢｔ０２３）逡逑和ＣｙｔｌＡａ邋（ｐＢｔ０２１）（图１－２），最初发现这四种蛋白都位于同一质粒ｐＢｔｏｘｉｓ邋（邋１２８邋ｋｂ）逡逑上，另外在质粒邋ｐＢｔｏｘｉｓ邋上还发现邋Ｃｒｙｌ０Ａａ（ｐＢｔ０４７）、Ｃｙｔ２Ｂａ邋（ｐＢｔ０３６）和邋ＣｙｔｌＣａ邋（ｐＢｔ０５４）逡逑三种次要蛋白（图１－２）邋［２９］。逡逑”。逡逑４邋ｆｒ＼＼％逡逑１＾２邋＼邋？ｂｐ逡逑图１－２质粒ｐＢｔｏｘｉｓ图谱【２９］逡逑Ｆｉｇ．邋１．２邋Ｍａｐ邋ｏｆ邋ｐｌａｓｍｉｄ邋ｐＢｔｏｘｉｓ【２９】逡逑

级联调节,芽胞杆菌,芽胞,可调节

１．３调控芽胞形成的主要转录因子逡逑最初证明在枯草芽胞杆菌沿，Ｂｓ）中主要的转录因子（ＳｐｏＯＡ、ｏＨ、ａＦ、ｇｅ、逡逑ｇｇ、ｃｊｋ）存在级联调节机制（图１－３）邋［５５］，后期又证明在苏云金芽胞杆菌［５６］与梭状芽胞杆逡逑菌属（Ｃ／Ｍｒ妨ｗｍｓｐｐ．）中也存在类似的机制；虽然它们之间的调节机制很大程度上相似，逡逑但也存在许多差异『５７］。芽胞的形成涉及７个发育阶段（图１－３）：早期营养体细胞的发育，逡逑细胞的不对称隔膜、前芽胞、芽胞皮层、芽胞衣逐步依次形成，最终芽胞成熟，细胞裂解逡逑并将芽胞释放［２，％。如图在形成芽胞之前由ＳｐｏＯＡ和ｃｊｈ调控，芽胞在早期主要受＃和￥逡逑因子的控制，而在晚期主要受和ａＫ因子的控制：在前芽胞中依次主要受＃和＃因子的逡逑控制，而在母细胞中依次主要受ｃｒＥ和＃因子的控制［５５１。前一个0因子的激活都是为后一个0逡逑因子的激活做铺垫，以此形成级联调节［５仇逡逑ＯｒｐＫｆｔｆｉ邋ＨＫｓ逦？备逡逑＠备邋广邋Ｐｔｘｗｐｈｏ＾ｌａｙ逡逑－？逦－＊＜ｅｌｈｂｒ逡逑ｊｊ逦ｆｕｎａｌｏｍ逡逑ｊＴ￣逦ｊ逡逑？ＪＢＩ逡逑Ｆｏｍｐｏｒｔ逦｜｜逦Ｍｏｔｈａｒ逦ｃｍＵ逡逑图１－３芽胞杆菌中ｃｊ级联调节机制Ｍ逡逑Ｆｉｇ．邋１．３邋ａ邋ｃａｓｃａｄｅ邋ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ邋ｍｅｃｈａｎｉｓｍ邋ｉｎ邋Ｂａｃｉｌｌｕｓ＾逡逑ｃ因子可调节许多ｃ＾ｙ／ｃ声基因的表达（表１－２）。研究发现

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