构巢曲霉来源α-葡萄糖苷酶的克隆表达及其应用研究

发布时间：2020-10-11 06:19

　　 α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase,EC.3.1.20)又叫α-D-葡萄糖苷水解酶,可从寡糖底物非还原端切开α-1,4糖苷键,将释放的葡萄糖单元以α-1,6键转移到麦芽三糖、麦芽糖或葡萄糖等分子上,获得异麦芽三糖、潘糖、异麦芽糖等低聚糖产物。它存在于自然界中,种类繁多,性质各异。目前,α-葡萄糖苷酶已广泛应用于低聚异麦芽糖生产、代谢生理研究、疾病预防治疗等各个领域。本研究从数据库中筛选获得转苷能力强而水解能力弱的构巢曲霉(Aspergillus nidulans,A.nidulans)α-葡萄糖苷酶。将A.nidulans来源α-葡萄糖苷酶基因AgdB连接到表达载体pPIC9K上,于Pichia pastoris KM71中表达,同时共表达N-乙酰转移酶,对重组菌株在3.6 L发酵罐中的发酵进行优化,并研究重组α-葡萄糖苷酶的酶学性质及其在合成低聚异麦芽糖和提高焦糊精中抗性含量的应用工艺。主要研究结果如下:(1)针对数据库中α-葡萄糖苷酶的转苷和水解能力特性,比较不同α-葡萄糖苷酶的遗传进化分类特性和三维结构特征结合文献报道,预测A.nidulans来源的α-葡萄糖苷酶(氨基酸序列GenBank:BAB39856.1)可能具有较强的转苷能力和较弱的水解能力的特点。根据NCBI已报道A.nidulansα-葡萄糖苷酶基因进行密码子优化后合成目的基因AgdB,并构建重组质粒pPIC9K-AgdB,整合到P.pastoris KM71中成功表达。(2)为提高目的蛋白的表达量和酶活,共表达N-乙酰转移酶Mpr1,以构建重组菌株P.pastoris KM71/pPIC9K–AgdB/pPICZ A–Mpr1,将该重组菌进行摇瓶诱导发酵,酶活达到22.56 U?mL~(-1),是未共表达Mpr1菌株的1.92倍。对该菌株进行3.6 L罐发酵培养条件优化,结果表明:当诱导温度25°C,诱导阶段甲醇浓度为1%时,酶活最高达到128.12U?mL~(-1),是摇瓶酶活的5.68倍。(3)对重组α-葡萄糖苷酶进行蛋白分离纯化以及酶学性质分析。研究结果表明,重组α-葡萄糖苷酶最适反应pH为5.5,最适反应温度为45°C,该重组酶在pH 3.5-8.0较稳定,在50°C下半衰期为24 h。重组A.nidulansα-葡萄糖苷酶对麦芽糖和麦芽三糖转苷动力学参数K_m值分别为1.78 mM和2.09 mM,其对麦芽糖、麦芽三糖亲和力分别是黑曲霉(Aspergillus niger,A.niger)α-葡萄糖苷酶的10.42和1.56倍。重组A.nidulanα-葡萄糖苷酶对麦芽糖、麦芽三糖的水解动力学参数K_m为2.91 mM和5.39 mM,A.nigerα-葡萄糖苷酶对麦芽糖、麦芽三糖水解亲和力是A.nidulansα-葡萄糖苷酶的5.49和7.19倍,结果表明A.nidulansα-葡萄糖苷酶具有转苷能力强而水解能力弱的特点。(4)优化A.nidulansα-葡萄糖苷酶制备低聚异麦芽糖的工艺。以30%麦芽糖为底物制备低聚异麦芽糖的最优条件为:pH 5.5,45°C,α-葡萄糖苷酶加酶量为5.1 U·g~(-1)麦芽糖,低聚异麦芽糖产量能达到最大值216.36 g·L~(-1),转化率为72.12%,是目前报道的以麦芽糖为底物合成低聚异麦芽糖的最高水平。以焦糊精为底物提高抗性含量的工艺进行优化,优化后的条件为:pH 5.5,45°C,加酶量2.75 U·g~(-1)焦糊精,反应6 h后可以使焦糊精中抗性含量由44.10%提高至63.10%。对Thermuobifida fusca来源的分支酶(TfSBE)、Bacillus stearothermophilus来源的环糊精转移酶(CGTase)和重组α-葡萄糖苷酶复配进一步提高焦糊精抗性含量的工艺进行研究,优化后条件为:在20%(w·v~(-1))焦糊精底物浓度下,首先反应条件调控在40°C,pH 6.5,TfSBE加酶量1500 U·g~(-1)焦糊精,反应12小时后,重新调整pH至5.5,同时加入5 U·g~(-1)焦糊精的α-葡萄糖苷酶和CGTase,在45°C下反应12 h,焦糊精的抗性含量由原先的44.10%提高至70.44%。
【学位单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q78
【部分图文】：

图 1-1 G13 α-葡萄糖苷酶 HaG 的三级结构(PDB,3WY4). 1-1 Three-dimensional structure of a GH31AGase：HaG (PD-葡萄糖苷酶参与许多重要生理代谢过程 G31 α-葡构域组成，包括 N 端结构域，(β/α)8-桶状催化结构试剂和酸碱催化剂分别位于 β-折叠片 4 和 6 的末结构也会参与底物结合过程，如图 1-2 苷酶显示出不同的底物选择性，但通常都具有 α-1化酶(MGAM)和蔗糖-异麦芽糖酶(SI)都属于 G31 α-两个催化亚基：N 末端亚基(NtSI 和 NtMGAM)和 C NtSI 具有 Trp327，这个 Trp 残基是被认为是赋予 N有实验表明，用 Trp 残基取代 CtMGAM 的 Tyr12异麦芽糖水解的 kcat/Km值[19] 定点诱变研究显示 Trp169 对 α-1,6 糖苷键特异性

图 1-2 G31α-葡萄糖苷酶 NtMGAM 的三级结构(PDB,2QMJ)[15]g. 1-2 Three-dimensional structure of a GH31AGase：NtMGAM (PDB,2Q酶发生酶促反应时，能够水解底物麦芽糖生成葡萄糖，得到子可以发生分子内转移生成异麦芽糖[22] α-葡萄糖苷酶转苷形选择性很高的反应过程，麦芽糖水解后的游离葡萄糖经 α-葡萄异麦芽糖分子[23]，通过 α-1,6 键的形式生成潘糖和异麦芽三糖

(c)图 1-3 麦芽糖生成异麦芽糖 潘糖 异麦芽三糖的反应机制Fig. 1-3 Reaction mechanism of (a) isomaltose (b) panose and (c) isomaltotriose with maltose assubstrate1.1.3 α-葡萄糖苷酶的应用α-葡萄糖苷酶在生产低聚异麦芽糖 制备抗性糊精等工业中具有重要作用[24] 低聚异麦芽糖又称分支低聚糖，是以淀粉为原料经酶糊化后采用 α-葡萄糖苷酶转苷反应生产的功能性低聚糖，主要成分是由 2-10 个葡萄糖残基组成的至少含有一个 α-1,6 键而其他为 α-1,4 键的分支糖[25] 市场上的低聚异麦芽糖主要成分包括异麦芽糖 潘糖 异麦芽三糖及四糖以上的具有功能性的分支糖浆，主要分为 IMOs50 型和 IMOs90 型，前者要求低聚糖含量占总糖的 50%以上，而后者则要求 90%以上 低聚异麦芽糖具有许多功能优点，如：(1)甜度较低，仅为蔗糖的 40%-50%，且能量也仅为蔗糖的 12.67%，可以作为低热量低甜度的甜味剂；(2)物理化学性质稳定，耐高温，耐酸碱，且具有一定黏度，易于食品的加工塑性；(3)具有良好的吸水性，可以保持食品的湿度；(4)添加至食品中
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本文编号：2836203