RNL酶促Henry反应研究及催化机理解析

发布时间：2020-10-11 01:40

　　 Henry反应是有机反应中形成C-C键的重要反应,该反应以硝基烷烃与醛或酮类为底物生成β-硝基醇类化合物。使用金属络合物等化学催化剂催化Henry反应存在反应条件苛刻、副反应多,污染大等弊端。而利用脂肪酶的催化功能多样性进行酶促Henry反应可以有效解决上述问题。目前,已发现少数几种脂肪酶具有催化Henry反应的能力,但反应活性及选择性均较差,且没有关于酶结构改造及催化机理解析的报道。因此本文对脂肪酶催化的Henry反应进行研究,从酶的筛选、纯酶的表达、催化机理的解析以及化学修饰改造等方面展开。首先,以苯甲醛与硝基甲烷为模式反应,对一系列常见的商品化脂肪酶进行筛选,获得反应活性较优的脂肪酶RNL,其在纯水体系中的产品产率为36.10%。对RNL进行蛋白电泳后发现,其目标蛋白纯度较低,杂蛋白含量多。因此选择毕赤酵母GS115作为载体,进行表达纯化。收获纯酶后,继续对该酶的基本酶学性质进行研究:RNL的最适温度为40℃,最适pH为8.0,在45℃环境中放置2 h后残余酶活仍达70%以上。接着,对RNL催化Henry反应的催化机理进行探究。首先,借助分子对接,发现活性中心附近10 A范围内存在五个氨基酸残基:Ser81、Phe82、Ile86、Ser145以及His257,可能参与了反应。随后,借助分子动力学模拟,对这些氨基酸位点在反应中的作用进行探究,发现催化三联体中的Ser145及His257通过与底物形成氢键,起到质子传递作用,是影响反应活性的关键氨基酸位点。Ser81、Phe82、Ile86通过与两底物形成弱键作用力,对底物进行“锚定”。并以此模拟结果为基础进行单点突变验证,对脂肪酶催化Henry反应的催化机理进行了初步解析。最后,为了进一步提高RNL的反应活性,使用化学修饰法对RNL酶的分子结构进行改造。结果表明,当RNL上的Arg残基被1,2-环己二酮(CHD)修饰后,产品产率提高1.4倍。接着通过对反应条件进行优化,得到了较优的反应条件:苯甲醛0.1 mmol;硝基甲烷2.5 mmol;pH 7.5磷酸缓冲液1 mL;RNL(CHD)修饰酶10 mg;35℃恒温搅拌反应24 h,使产品产率进一步由48.15%提升至66.70%。随后,对该反应适用的底物范围进行考察,发现RNL可催化一系列芳香醛与硝基烷烃发生反应,且均取得较好的收率,其中以对硝基苯甲醛为底物时产率最高,达99.43%。
【学位单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q55
【部分图文】：

？〇２?９?ｂａｓｅ?２??＋?ｈ＾Ｒ３?＾＾?Ｒ３??Ｎ〇２??图１．２?Ｈｅｎｒｙ反应??Ｆｉｇｕｒｅ?１．２?Ｈｅｎｒｙ?ｒｅａｃｔｉｏｎ??Ｐ－硝基醇在有机合成中可被用于合成许多关键中间体，如：硝基烯烃，２－氨??基醇，２－硝基酮和诸多具备生物活性的化合物。同时其也被广泛应用于制药工业??中，是许多活性药物，如鞘氨醇和麻黄碱的成分。??２??

图１．２?Ｈｅｎｒｙ反应??Ｆｉｇｕｒｅ?１．２?Ｈｅｎｒｙ?ｒｅａｃｔｉｏｎ??

图１．３?Ｈｅｎｒｙ反应的综合应用１９］??Ｆｉｇｕｒｅ?１．３?Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ?ｕｔｉｌｉｔｙ?ｏｆ?ｔｈｅ?Ｈｅｎｒｙ?ｒｅａｃｔｉｏｎ１９１??目前对于Ｈｅｎｒｙ反应的化学催化机理，已经研究得较为透彻。如图１．４，在反??应过程中，底物硝基烷烃上的ａ－碳原子在碱的作用下去质子化，生成碳负离子。??后者进攻醛类物质羰基上的碳原子，亲核加成，最终得到产物Ｐ－硝基醇。??Ｑ??／￣＼?广??／?＼?Ｄｃｐｒｏｔｏｎａｔｉｏｎ?（??Ｒ?Ｒ２＾ｎｏ２??Ｒ２?Ｎ〇２??Ｎｉｔｒｉｌｅ?ｅｓｔｅｒ??ＯＨ?／?＼??Ｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｉｃ?ｂｏｎｕｓ?Ｎ０２?＋?／?＼??Ｒ?Ｒ＊?Ｉ?Ｈ??ｒ２??图１．４?Ｈｅｎｒｙ反应化学催化机理??Ｆｉｇｕｒｅ?１．４?Ｃｈｅｍｉｃａｌ?ｃａｔａｌｙｔｉｃ?ｍｅｃｈａｎｉｓｍ?ｏｆ?Ｈｅｎｒｙ?ｒｅａｃｔｉｏｎ??３??
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本文编号：2835859