双水相浮选体系的设计构建及其在分离纯化菠萝蛋白酶和融合β-葡萄糖苷酶中的应用研究

发布时间：2020-10-21 06:32

　　 酶是一种能够催化特定化学反应的生物催化剂。因其温和的反应条件、对底物的专一性和高效率的催化活性,已在诸多工业领域广泛应用。然而,对植物来源的酶或是微生物来源的酶来说,将其从复杂的体系中分离出来的同时又要防止其结构的改变以及生物活性的丧失,一直是其分离纯化过程中的关键问题。双水相浮选技术作为一种复合型分离技术,具有纯化步骤简易、操作环境温和和易于放大等优点,因而被逐渐引入到对生物制品的分离纯化中。本文以菠萝蛋白酶和融合β-葡萄糖苷酶为例,构建新型的双水相浮选体系对酶进行分离纯化,具体内容如下:(1)设计合成了温敏聚合物L64-IDA-Cu(Ⅱ)作为浮选捕集剂,并利用FT-IR、原子吸收光谱法和透射率实验对其结构和温敏性能进行研究。通过考察一系列离子液体(IL)和盐对菠萝蛋白酶的酶活稳定性影响,构建[Bmim]Br-K2HPO4的离子液体双水相浮选(ILATPF)体系,并以L64-IDA-Cu(Ⅱ)为捕集剂结合ILATPF对菠萝蛋白酶进行分离纯化。通过单因素实验和响应曲面法(RSM)优化得到实验条件:盐浓度,浮选时间,L64-IDA-Cu(Ⅱ)浓度,IL浓度和浮选流速分别为0.50 g/mL,30min,0.30g/L,60%和30mL/min,并得出最佳浮选效果:Ye和Kp值分别达到97.43%和3.45。对于浮选分离后得到的L64-IDA-Cu(Ⅱ)-菠萝蛋白酶复合物以及上相离子液体的混合物,利用L64-IDA-Cu(Ⅱ)的温敏性能,通过两步沉淀去除离子液体和L64-IDA-Cu(Ⅱ)本身,实现最终纯化(得到的菠萝蛋白酶的Ye、Kp和PF值为96.90%、5.97和7.18)。接着将本实验方法与其他纯化方法进行比较,证明本实验方法具有良好的纯化效果。最终通过SDS-PAGE分析,证明纯化的菠萝蛋白酶的纯度优良,并用紫外吸收光谱分析(UV-vis)、FT-IR和圆二色谱(CD)验证纯化过程对菠萝蛋白酶的结构没有造成影响。(2)本实验成功表达了含GB和ELP标签的融合β-葡萄糖苷酶(Glu):Glu-linker-ELP-GB(GLEGB)。通过考察一系列聚合物、盐和表面活性剂对Glu的酶活稳定性影响,构建了 PEG-(NH4)2SO4的ATPF体系。然后利用融合蛋白GLEGB上的GB标签的疏水作用结合ATPF对融合蛋白进行初步纯化。通过单因素实验和RSM优化得到ATPF纯化GLEGB的条件:PEG 2000浓度,BS-12浓度,浮选时间和浮选流速分别为40.00%,1.50%,30 min和30 mL/min,并得到最佳的浮选效果:Ye和PF值分别为172.86%和9.58。然后对于得到的GLEGB和PEG2000的混合液,利用GLEGB上的ELP标签的逆转换循环(ITC)特性去除PEG 2000,得到进一步纯化的GLEGB水溶液(纯化的GLEGB的Ye和PF值达到 124.92%和24.26)。并将ATPF-ITC联用方法用于其他酶(Glu、Glu-linker-ELP(GLE)、Glu-linker-GB(GLG)、Glu-linker-ELP-6His(GLEH))的分离纯化,证明了GB和ELP标签联用的良好纯化效果。最后通过SDS-PAGE分析,证明纯化的GLEGB的纯度良好,并通过UV-vis、FT-IR和CD对购买的Glu和纯化的GLEGB进行比较,验证纯化过程对酶的结构没有造成影响。
【学位单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q814.1
【部分图文】：

置：1. 气体钢瓶 2. 转子流量计 3.浮选池ublation apparatus: 1. Gas cylinder; 2. Pin-tycell; 4. Glass sand filter board 5. Outlet valv直接通气来进行浮选，气体主要由压，比如空气、氦气和氮气等，本实验瓶上的不同阀门，靠它们控制气体压体流速，常用的是转子流量计和皂膜量计。浮选柱根据各自需求进行定制用 G3 或 G4 的玻砂滤板，从而使通入。本实验采用的是玻璃材质，容量为 个装置之间由橡皮管进行连接。

和的气泡传质进行质量传递，从而可有效抑制乳化现象；件温和：整个过程不使用有机溶剂，体系生物相容性好，比 PEG 和 Dex 不仅无毒，而且还可以用作蛋白质的稳定剂；作简单：双水相浮选设备简单，投资小，并可根据处理样品浮选柱，同时易于连续化操作。相浮选的基本原理 主要基于目标物在气泡上的吸附，并由气泡传递转移进入浮选。经过不断演变，Valsaraj[13]建立了相对完整的浮选模型(如型阐述：目标物在浮选体系中主要通过三种途径在两相之间物吸附或随捕集剂共同吸附到气泡上，并随气泡转移至上相进行物质转移，主要是依赖浓差扩散；三是目标物通过气泡表作用进行物质转移，其中部分目标物又随小液滴返回至水相

型号 DF-101S 河南省巩义予TGL-16aR 上海安Nicolet Nexus 470 美国PHS-3C 上海精密BS 124S 赛多利斯UV-2450 日KQ-250B 101 昆山市超DZF 6020 河南省巩义予DHG-9145A 上海一恒/ 行，气泡由氮气经 G4 玻砂滤板体流速，装置如图 2.1 所示。
【参考文献】

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本文编号：2849774