高温噬菌体裂解酶TSPpgh的抑菌作用研究

发布时间：2020-10-21 11:57

　　 M23家族蛋白酶具有内肽酶和酰胺酶活性,能降解细菌细胞壁肽聚糖,作为新型的蛋白类抗生素倍受关注。部分噬菌体裂解酶属M23家族蛋白酶,能高效地裂解多重耐药性细菌,使其有望应用于取代传统的抗生素治疗。本文在已获得腾冲热海栖热菌噬菌体TSP4基因组的基础上,分析此噬菌体裂解酶基因的基本特征,对裂解酶基因进行克隆表达,同时探索利用高温酶热稳定性高的特点,建立基于菌体热裂解的重组裂解酶快速纯化方法,并通过抑菌活性和AFM观察评价纯化后裂解酶的活性。最后将裂解酶用可溶性淀粉吸附制备成酶制剂,定期评价酶制剂的酶活变化。为了探索裂解酶的裂解机理,本文分别利用革兰氏阴性菌大肠杆菌、革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌的肽聚糖,与裂解酶进行反应,研究其对肽聚糖的吸附特征,通过液质联用分析裂解酶水解肽聚糖的位点,并进一步通过对裂解酶基因的定点突变,验证裂解酶的活性位点及特征。为了探索裂解酶的抑菌效果,本文通过致死率分析及电镜观察,评价裂解酶对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和多重耐药肺炎克雷伯氏菌的抑菌效果。并通过在小鼠身上制造了皮肤伤口,定殖耐药金黄色葡萄球菌随后用TSPpgh对局部进行治疗,探索裂解酶在治疗多重耐药金黄色葡萄球菌在外伤感染中的作用。结果表明,栖热菌噬菌体TSP4裂解酶TSPpgh属于M23肽酶家族,推测motif HXXXD和HXH为TSPpgh的活性位点,并进行了突变验证。将裂解酶基因TSPpgh克隆表达后,得到分子量19 KDa的重组蛋白。通过对诱导表达后的发酵液升温至55℃并维持20分钟,能使细胞破裂并变性沉淀去除掉绝大多数表达菌株大肠杆菌的蛋白,从而实现裂解酶的快速纯化,结合高密度发酵技术,发酵液中裂解酶浓度可达2 mg/mL。裂解酶对金黄色葡萄球菌ATCC 6538的杀菌效率最高,可达90%。通过AFM观察表明,TSPpgh裂解了大肠杆菌BL21(含TSPpgh质粒)和金黄色葡萄球菌的细胞壁,制备的酶制剂在20℃保存一年其酶活能保持75%。裂解酶TSPpgh能够吸附和水解革兰氏阴性菌和阳性菌的肽聚糖,并且能够水解弹性蛋白。通过液质联用分析TSPpgh水解肽聚糖的位点表明,TSPpgh还能够水解糖苷键Glcp-β-1’-6’-Glcp-β-1’-1’,具有糖苷酶的活性。抑菌实验表明,TSPpgh在37℃、酶浓度为68μg/mL的浓度下,裂解酶TSPpgh对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌CMCC(B)50094和大肠杆菌CMCC(B)44102菌株的致死率达90%,对多重耐药肺炎克雷伯氏菌的致死率高达80%以上,部分致死率可达100%;通过SEM观察表明,裂解酶TSPpgh通过裂解作用而实现其杀菌功能。本研究在小鼠身上制造了皮肤伤口,定殖耐药金黄色葡萄球菌2612-1606BL1486,随后用TSPpgh对局部进行治疗。在为期9天的治疗期间,TSPpgh和卡那霉素均快速的促进了伤口愈合。验证了裂解酶TSPpgh在治疗多重耐药金黄色葡萄球菌在外伤感染中的作用。本文建立了高温裂解酶的高效表达和快速纯化方法,结合此裂解酶较广泛的细菌裂解谱、较高的裂解酶活性以及热稳定性,使其具有较好的生产应用前景,其对多重耐药菌良好的杀灭效果,有助于其作为新型的酶抗生素应用于医药研发。
【学位单位】：昆明理工大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q55
【部分图文】：

昆明理工大学2图1.1长尾科噬菌体电镜形态[2]图1.2肌尾科噬菌体电镜形态[2]Fig1.1.ElectronmicroscopicmorphologyFig1.2.ElectronmicroscopicmorphologyofSpihoviuseofMyoviridae图1.3丝状科噬菌体电镜形态[2]图1.4覆层噬菌体电镜形态[2]Fig1.3.ElectronmicroscopicmorphologyFig1.4.ElectronmicroscopicmorphologyofInoviridaeofTectiviridae多年来对腾冲热海嗜热菌的研究，证明了以嗜热菌和藻类垫为代表的微生物区系和群落结构的多样性。嗜热噬菌体的研究将进一步丰富和扩大人们对该地区微生物多样性的认识。嗜热微生物是一类生活在高温环境中的微生物，如火山口及其周围区域、温泉、工厂高温废水排放区等。近30年来，这一类微生物越来越广泛地引起了科学家们的重视和兴趣。特别是在水的沸点和沸点以上温度条件下能生活的细菌被发现后，更促进了对嗜热微生物的研究。极端微生物具有理论研究价值，且有着诱人的生物技术开发前景，关于这类生物的研究已经成为微生物学研究中的一大热点，极端微生物噬菌体由于其独特的生物学地位，在生命的进化与起源中可能扮演着举足轻重的作用，加之对其的研究可能蕴含着巨大的应用价值，因此加快高温菌噬菌体研究的步伐成为不少研究者共同的愿望。

昆明理工大学2图1.1长尾科噬菌体电镜形态[2]图1.2肌尾科噬菌体电镜形态[2]Fig1.1.ElectronmicroscopicmorphologyFig1.2.ElectronmicroscopicmorphologyofSpihoviuseofMyoviridae图1.3丝状科噬菌体电镜形态[2]图1.4覆层噬菌体电镜形态[2]Fig1.3.ElectronmicroscopicmorphologyFig1.4.ElectronmicroscopicmorphologyofInoviridaeofTectiviridae多年来对腾冲热海嗜热菌的研究，证明了以嗜热菌和藻类垫为代表的微生物区系和群落结构的多样性。嗜热噬菌体的研究将进一步丰富和扩大人们对该地区微生物多样性的认识。嗜热微生物是一类生活在高温环境中的微生物，如火山口及其周围区域、温泉、工厂高温废水排放区等。近30年来，这一类微生物越来越广泛地引起了科学家们的重视和兴趣。特别是在水的沸点和沸点以上温度条件下能生活的细菌被发现后，更促进了对嗜热微生物的研究。极端微生物具有理论研究价值，且有着诱人的生物技术开发前景，关于这类生物的研究已经成为微生物学研究中的一大热点，极端微生物噬菌体由于其独特的生物学地位，在生命的进化与起源中可能扮演着举足轻重的作用，加之对其的研究可能蕴含着巨大的应用价值，因此加快高温菌噬菌体研究的步伐成为不少研究者共同的愿望。

昆明理工大学2图1.1长尾科噬菌体电镜形态[2]图1.2肌尾科噬菌体电镜形态[2]Fig1.1.ElectronmicroscopicmorphologyFig1.2.ElectronmicroscopicmorphologyofSpihoviuseofMyoviridae图1.3丝状科噬菌体电镜形态[2]图1.4覆层噬菌体电镜形态[2]Fig1.3.ElectronmicroscopicmorphologyFig1.4.ElectronmicroscopicmorphologyofInoviridaeofTectiviridae多年来对腾冲热海嗜热菌的研究，证明了以嗜热菌和藻类垫为代表的微生物区系和群落结构的多样性。嗜热噬菌体的研究将进一步丰富和扩大人们对该地区微生物多样性的认识。嗜热微生物是一类生活在高温环境中的微生物，如火山口及其周围区域、温泉、工厂高温废水排放区等。近30年来，这一类微生物越来越广泛地引起了科学家们的重视和兴趣。特别是在水的沸点和沸点以上温度条件下能生活的细菌被发现后，更促进了对嗜热微生物的研究。极端微生物具有理论研究价值，且有着诱人的生物技术开发前景，关于这类生物的研究已经成为微生物学研究中的一大热点，极端微生物噬菌体由于其独特的生物学地位，在生命的进化与起源中可能扮演着举足轻重的作用，加之对其的研究可能蕴含着巨大的应用价值，因此加快高温菌噬菌体研究的步伐成为不少研究者共同的愿望。
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本文编号：2850089