两株特殊生境微生物次级代谢产物及倍半萜合酶的研究

发布时间：2020-10-21 13:21

　　 微生物天然产物是新药研发的重要来源,其中特殊生境微生物在各种环境胁迫因素的影响下,能产生更多结构新颖、生物活性独特的天然产物。采用基因组导向的天然产物挖掘策略,运用基因组学、生物信息学、天然产物化学和合成生物学等多学科交叉融合手段,对特殊生境微生物进行新颖基因的挖掘和新颖天然产物结构的鉴定,能够避免大量已知化合物的重复发现,为天然产物研究提供新的机遇。本论文对实验室自主构建的植物病原真菌和海洋放线菌的基因组库进行生物信息学分析,通过antiSMASH网站进行基因簇预测和分析,从中选取次级代谢产物较为丰富的植物病原真菌麦根腐平脐蠕孢菌Bipolaris sp.11134和海洋疣孢菌Verrucosispora sp.MS1003菌作为研究对象,通过单菌多产物策略(OSMAC)激活生物合成基因簇,研究新的代谢产物结构,并对真菌中倍半萜合酶及其环化机制进行研究。从麦根腐平脐蠕孢菌Bipolaris sp.11134中分离得到6个seco-sativene类倍半萜化合物(1-6),其中包括3个新化合物sesquisorokins A-C(1-3)。Seco-sativene类化合物含有独特的双环[3.2.1]桥环结构,该类型结构的生物合成机制尚未报道。从可能的生物合成机制分析,发现其包含罕见的裂环机制,因此本论文进一步对其关键合酶展开了相关研究。利用生物信息学分析发现了Bipolaris sp.11134的基因组中含有4个潜在的倍半萜合酶基因序列,结合其所在的基因簇深入分析,通过构建酿酒酵母、大肠杆菌、构巢曲霉三种异源表达体系对潜在倍半萜合酶进行体内异源生产,鉴定环化产物的结构以及体外酶学催化实验表征倍半萜合酶的功能,并进一步结合已经鉴定的倍半萜化合物化学结构,推测其生物合成途径。此外,比较基因组学分析显示,海洋疣孢菌Verrucosispora sp.MS1001 37与能够产生具有抗MASR活性的abyssomicin类化合物的V.maris AB-18-032含有相同的生物合成基因簇,在进行基因簇注释时发现其含有尚未有功能鉴定的黄素依赖的环氧化酶,本论文通过OSMAC发酵和LC-MS实验进一步挖掘Verrucosispora sp.MS10037的次级代谢潜力,通过放大发酵、分离纯化共得到7个化合物(7-13),综合运用高分辨质谱、核磁共振和圆二色谱等多种现代波谱学技术,鉴定为4个abyssomicin类化合物(7-10)和3个proximicin类化合物(11-13),其中abyssomicin Y(7)是abyssomicin类化合物结构中C8和C9位上的双键被环氧基团取代的新化合物,进一步的基因功能鉴定正在进行中。
【学位单位】：安徽大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q936
【部分图文】：

素（ｆｏｓｆｏｍｙｃｉｎ，Ｒ１）?７能够通过抑制革兰氏阳性菌和阴性菌中肽聚糖的生物合成??导致细菌细胞裂解和死亡８；甘氨酰四环素类新型抗生素如替加环素（ｔｉｇｅｃｙｃｌｉｎｅ，??Ｒ２）能够应对金黄色葡萄球菌的抗生素耐药问题９。表１．１和图１．２列出了目前??经ＦＤＡ批准上市的天然产物来源的部分抗菌药物。??表１．１天然产物来源的抗菌代表性药物??Ｔａｂｌｅ?１．１?Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ?ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ?ｄｍｇｓ?ｄｅｒｉｖｅｄ?ｆｒｏｍ?ｎａｔｕｒａｌ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ??ａｍ．?化合物名称?作用?来源?市参考??＾?（英文名，商品名）?＾＾?年代文献??Ｒ１?ｒ?广谱抗生素?Ｓ‘?ｆｒａｄｉａｅ?１９９８?７??Ｃ１?ｏｓｉｏｍｙｃｍ？?ＩＶｌｏｎｕｒｉｌ）??替加环素?金黄色葡萄球?甘氨酰四环素类衍?９??１?￣?（ｔｉｇｅｃｙｃｌｉｎｅ，?Ｔｙｇａｃｉｌ）?菌等耐药菌株?生物??Ｒ３?非达霉窄谱抗生素＂轉切—膽?２〇１１?１０??（ｆｉｄａｘｏｎｕｃｉｎ，?Ｄｉｆｉｃｉｄ）?ａｕｒａｎｔｉｃｕｍ??Ｒ４?（ｃｅｆｂｔ＾＾ｐｏｎｎ）?＾谱抗生素麵素麵生物ｉ撕??Ｒ５?Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ?ｍｕｔｉｈｉｓ?２００７?１２－１３??（ｒｅｔａｐａｎｉｕｌｉｎ

?Ｖａｌｒｕｂｉｃｉｎ?（Ｒ１１）?Ｏｓｅｌｔａｍｉｖｉｒ?（Ｒ１２）?Ｇａｌａｎｔｈａｍｉｎｅ?（Ｒ１３）??图１．３天然产物来源的抗肿瘤及抗病毒代表性药物化学结构式（Ｒ６－Ｒ１３）??Ｆｉｇ?１．３?Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ?ａｎｔｉｔｕｍｏｒ?ａｎｄ?ａｎｔｉｖｉｒａｌ?ｄｒｕｇｓ?ｄｅｒｉｖｅｄ?ｆｒｏｍｂｙ?ｎａｔｕｒａｌ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ??（Ｒ６－Ｒ１３）??在众多的天然产物来源的药物中，萜类成分的研究是非常活跃的领域，也是??寻找和发现天然药物先导性分子以及其它功能分子的重要源泉。据统计，目前己??知的萜类化合物的总数超过８万种，其代表性明星药物青蒿素和紫杉醇广为人知??２３＿２４。青蒿素（ａｒｔｅｍｉｓｉｎｉｎ，Ｒ１４）是提取自黄花蒿的一种含有过氧桥键的倍半萜??内脂类化合物，是目前为止见效最快的抗恶性疟原虫疟疾药物２５。１９６９－１９７２年??间，我国科学家屠呦呦带领课题组成员发现并从黄花蒿中提取了青蒿素２５，并因??此获得２０１５年诺贝尔生理学或医学奖。另一种明星药物紫杉醇（ｐａｄｉｔａＸｅｌ，Ｒ１６）??被用来治疗包括卵巢癌、乳癌、肺癌和胰脏癌在内的多种癌症２６。自１９９２年获??得ＦＤＡ批准到２０００年

挖掘借助自动化工具进行开发，包括ＢＡＧＥＬ７７、ＣＬＵＳＥＡＮ７８和ａｎｔｉＳＭＡＳＨ７９等??工具的出现，极大地加速了研宄人员的进展。??图１．８和表１．４列举了部分通过基因组挖掘发现的新天然产物，如Ｃｈａｌｌｉｓ等??人在天蓝色链霉菌Ｘ?ｃｏｅ／／ｃｏ／ｏｒ中通过基因组挖掘非核糖体肽合成酶（ＮＲＰＳ）基??因簇发现的新肽类天然产物ｃｏｅｌｉｃｈｅｌｉｎ?（Ｒ２４）?８Ｇ；?Ｇｅｒｗｉｃｋ团队利用基因组挖掘??方法分析荧光假单胞菌Ｐｆ－５的全基因组序列得到新的脂肽类化合物Ｏｒｆａｍｉｄｅ?Ａ??（Ｒ２５）８１；?Ｏｎａｋａ等人使用基因组挖掘的方法，用强启动子替换内源性启动子从??而将ｌａｃｔａｚｏｌｅ?Ａ?（Ｒ２６）的产量提高３０倍８２；?Ｍａｔｓｕｄａ团队从生物信息学角度出??发挖掘結类合酶发现二砲新化合物ｓｔｅｌｌａｔｉｃ?ａｃｉｄ?（Ｒ２７）?Ｓ３。??ｉｉ??
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本文编号：2850167