新型葡萄糖氧化酶的基因克

发布时间：2020-10-21 15:57

　　 葡萄糖氧化酶(GOX)已广泛应用。目前,除了曲霉和青霉属来源的GOX外,很少有新型GOX被报道。本研究采用平板显色的方法对实验室保存的真菌进行产GOX的筛选,耐寒枝孢菌Cladosporium neopsychrotolerans SL16表达了GOX活性。根据其基因组测序数据,克隆了GOX编码基因CngoxA。另外,根据GOX序列相似性,从枝孢菌C.tianshanense SL19和一株黑曲霉Aspergillus niger MJ5中克隆得到5个可能的GOX基因,分别为CngoxB、AngoxA5、AngoxA7、AngoxA8和AngoxA3。CngoxA和CngoxB编码的蛋白与已报道验证功能的GOX最高一致性为35%,两者间一致性为80%,均为新颖的GOX。AngoxA5编码的蛋白与已验证功能的GOX最高一致性为97%,而AngoxA7、AngoxA8和AngoxA3编码的蛋白与已报到GOX序列相似性约为50-68%。6个基因在毕赤酵母Pichia pastoris中进行表达,只有CngoxA和AngoxA5表达了具有葡萄糖氧化酶活性的蛋白。来源于C.neopsychrotolerans SL16的CnGOXA在20℃和pH 7.0的条件下具有最高活性,在0℃时依然具有75%的酶活力,属于低温酶,在40℃时的半衰期为15 min,在pH 6.0–9.0条件下稳定。CnGOXA比活力为90 U·mg~(-1),K_m和V_(max)分别是103 mM和90.1μmol·min~(-1)·mg~(-1)。CnGOXA对SDS具有较强抗性,5 mM和10 mM的SDS对其酶活力均无影响。重组的AnGOXA5的性质与A.niger来源的GOX(1CF3)性质相似。经过序列分析发现C.tianshanense SL19来源的CnGOXB C端较CnGOXA短,将CngoxA中对应的核酸序列拼接到CngoxB中获得了CngoxB-m1,并成功在毕赤酵母中表达,比活为123.8 U·mg~(-1),高于CnGOXA。为了提高CnGOXA的稳定性和催化活性,我们对CnGOXA进行了突变研究。在CnGOXA的Y169和A211位点引入二硫键(Y169C-A211C),构建了突变体CnGOXA-M1。毕赤酵母中表达的CnGOXA-M1的最适pH与CnGOXA一致,而最适温度为25℃,较CnGOXA提高了5℃,其热稳定性和pH稳定性有了大幅提升,在40°C时的半衰期较野生型提高了48倍(720 min vs.15min),pH稳定范围由pH 6.0–9.0扩大到pH 3.0–12.0,比活为123.8U·mg~(-1),较CnGOXA提高了37%。在CnGOXA-M1基础上,通过引入pi-pi键、氢键作用网络、盐桥以及表面电荷相互作用构建了T525H、G147R、E74K、E150K和E476K位点突变体,它们的热稳定性与CnGOXA-M1相比均提高。将5个位点组合获得了突变体CnGOXA-M2,相比于CnGOXA-M1,其在50℃处理1 h后剩余酶活力提高了约200倍(79.8%vs.0.4%),比活为166.2 U·mg~(-1),提高了34%。面包烘焙实验结果表明CnGOXA-M1和A.niger来源GOX在面粉中的最佳添加量分别为6和4 U·kg~(-1),对应面包的体积与质量比分别为6.4和6.2 cm~3·g~(-1),相比于未添加酶的空白对照组(5.9 cm~3·g~(-1)),均有效地促进了面包体积增加,而CnGOXA-M1效果更佳。本研究克隆了6个葡萄糖氧化酶基因,其中3个基因在毕赤酵母中成功进行表达并检测到了GOX活性。对CnGOXA进行了突变研究,有效提高了其热稳定性、pH稳定性和催化活性。CnGOXA-M1在面包烘焙实验中可有效促进面包体积增加。另外,CnGOXA-M1、M2在低温、中碱性条件下酶活力高以及抗SDS的特性使其在洗涤及水产饲料添加剂工业中具有应用潜力。
【学位单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q78;Q55
【部分图文】：

第一章 引 言1 葡萄糖氧化酶的结构及催化机理.1 葡萄糖氧化酶的结构葡萄糖氧化酶(GOX, EC1.1.3.4)是一种黄素依赖型蛋白，属于葡萄糖/甲醇/胆碱氧化还原。目前，黑曲霉（Aspergillus niger）和尼崎青霉(Penicillium amagasakiense)来源的 GOX 晶得到了报道（PDB code: 1CF3、3QVP、5NIT、5NIW 和 1GPE 等）。从晶体结构中可以看出A），GOX 以同源二聚体的形式存在，分子量约为 160 kDa。每个亚基非共价结合一个 FA，而两个亚基通过盐桥和氢键等作用力作用接触在一起。GOX 单亚基晶体结构中已鉴定 N-糖基化修饰位点，在 A. niger 来源的 GOX 中分别为 Asn89，Asn161，Asn355 和 Asn388 (Kal., 1991)。在 Asn89 处形成的糖链间相互作用进一步稳定了二聚体，而且该糖链与一个 构(75 至 98 位氨基酸残基)共同组成了催化入口处的盖子结构(Wohlfahrt et al., 1999)。目前底物复合物晶体结构尚未得到报道。从同源建模推导的结果来看，在 GOX 结构中 Tyr6n514，Arg512，His516，His559 和 Thr / Ser110 可以与底物相互作用，其中 His516 和 Hi能发挥着催化底物的作用(Witt et al., 1998; Petrovic et al., 2017)（图 1.1B）。

X 催化葡萄糖生成葡萄糖内酯的反应机理 B. GOX 的催2017）nism of GOX. A. The reaction mechanism of GOX catalyzinB. The catalytic center structure of GOX来源、基因克隆与表达X 是来源于曲霉和青霉属。目前已在黑曲霉（A. nitteveen et al., 1990)，土曲霉（A. terreus）(Ah013)，米曲霉（A. oryzae）(Gunasundari, 2014)，炭霉（A. tubingensis）(M. Kriaa et al., 2016)等曲agasakiense）(Guido et al., 2015)，嗜松青霉（Panescens）(Simpson, 2005)，瘿青霉（P. fellutanuetzii）(Mikhailova et al., 2007)，变幻青霉（P. var

位论文 第二章 葡萄糖氧化酶基温度，标准反应条件下测定葡萄糖氧化酶的酶活，绘制最适温度段时间，然后在标准反应条件下测定酶活，计算相对酶活力，绘酶动力学参数的测定底物（20–1,600 mM），在标准反应条件下，测定葡萄糖氧化酶件绘制酶反应动力学曲线，计算 Km和 Vmax值。化酶菌株的筛选结果在 MB 固体平板菌落上覆盖葡萄糖氧化酶活性验证液过夜 25 chrotolerans SL16)菌落周围呈现深褐色，因此该菌株作为了后续菌 SL16 亲缘关系较近的枝胞菌 SL19 (C. tianshanense SL19)菌落这一现象后续我们也进行基因克隆研究。
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本文编号：2850325