矮牵牛MIR159基因敲除对生长发育的影响
发布时间：2020-10-22 17:02
MicroRNA(miRNA)是一类其长度约为20-24个核苷酸并且具有调节功能的非编码RNA。自从miRNA被发现以来,miRNA的功能作用和特异性表达等研究报道接踵而至,到如今miRNA已经被科学家鉴定为是参与各种生物生命活动的重要因子,包括细胞的增殖和分化、人类疾病的自身免疫以及生物与非生物胁迫等。MiR159基因家族是植物学领域中最古老,最保守的miRNA家族之一,其进化祖先能追溯到苔藓类。目前研究发现该家族包括三个成员,分别是miRl59a、miRl59b、miRl59c,其中最主要的成员是miRl59a和miRl59b。miR159主要的靶基因为MYB类转录因子,常见的有MYB33、MYB65、MYB97、MYB101等。MiR159基因家族功能丰富,不仅参与植物的营养生长、生殖生长,还参与生物和非生物胁迫。miR159靶基因MYB33的过表达导致叶片较小,叶柄较短,miR159a和miR159b功能缺失的突变体不能形成完整的花,miRl59b调控番茄种子发育等。虽然对miR159在多种植物中的功能有一定的研究,但对其在植物观赏性状发育中的作用研究不多。本实验拟运用基因敲除和超量表达的方法探究miR159在观赏植物矮牵牛中的功能,实验取得了以下研究成果:1.矮牵牛miRl59a和miRl59b基因敲除载体构建与转基因植株的获得利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,分别设计两个靶位点来构建miRl59a和miRl59b基因敲除载体,通过农杆菌侵染法转化矮牵牛,经过Basta筛选后得到了抗性株系,采用CTAB法提取抗性株系的DNA,进一步PCR、凝胶电泳检测观察发现有3个抗性株系的条带有片段缺失的现象,最后经测序鉴定,确认了3个发生片段缺失的miRl59b基因敲除突变体株系,分别命名为639-2,5,6(其中639-2与639-5的突变类型完全一致)。2.MiR159b基因敲除突变体的表型观察将基因敲除植株的组培苗移栽至田间管理,进行初步观察并收集种子,然后播种进而对Genome Editing 1(E1)代突变体进行表型观察和数据分析:miRl59b基因敲除突变体与野生型矮牵牛相比,叶片面积变大,株高变高,现蕾期的叶片数增多,开花时间略晚。提取植株花蕾总RNA并经荧光定量分析发现:MYB1在miRl59bE1代突变体中的表达量高于野生型,而MYB2在miRl59bE1代突变体中的表达量低于野生型。3.miRl59b超量表达载体的构建根据矮牵牛基因组设计miRl59b基因的引物序列miR159b-F/miRl59b-R,从野生型矮牵牛中克隆得到miRl59b基因,将目的基因与克隆载体pMD19-T连接构建中间载体,然后分别酶切pG605和miRl59b基因超量表达的中间载体,进而连接构建miRl59b超量表达载体,为进一步分析miRl59b基因的功能提供有利条件。
【学位单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S681.9;Q943.2
【部分图文】：
3.3 结果与分析3.3.1 矮牵牛 miR159a 基因敲除载体的构建以 pUC119-AtU6-gRNA 为模板，使用引物 M13F+159a-sgR1 和 M13R+159a-sgF1 进行第一轮扩增，得到片段一和片段二（如图 3-1），再以片段一和片段二为混合模板，使用引物 M13F+M13R 进行第二轮扩增，胶回收得到片段三（如图 3-2）。用 KpnI 和 XhoI 分别酶切片段三和 pcoCas9 质粒，胶回收目的条带，将片段三的目的片段连接到 pcoCas9 质粒的载体片段上，转化大肠杆菌，PCR验证，将检测出条带的菌液送测，测序正确后命名为 pG638-M。以 T617N-1 为模板，使用引物 M13R+159a-sgR2 和 M13F+159a-sgF2 进行第一轮扩增，得到片段一和片段二（如图 3-3），再以片段一和片段二的混合物为模板，使用引物 M13F+M13R 进行第二轮扩增，胶回收得到片段三（如图 3-4）。用 EcoRI+XbaI 分别酶切片段三和 pG638-M 质粒，将目的片段连接到 pG638-M和质粒的载体片段上，转化大肠杆菌，经 PCR 和凝胶电泳检测验证，测序正确后命名为 pG638（如图 3-5），载体见图如 3-6 所示。
图 3-2 pG638-M 片段三的电泳检测图Fig.3-2 Electrophoretic detection of pG638-M fragments 3图中泳道 1 为 Maker DL2000，泳道 2，3 为片段三。In the figure, Lane 1 is Maker DL2000, Lane 2, 3 is fragment 3.图 3-3 重叠 PCR 合成靶点二的 sgRNA 序列Fig.3-3 Overlapping PCR to synthesize sgRNA sequence of target 2泳道 1 为 Maker DL2000，泳道 2，3 为片段二，泳道 4，5 为片段gure, Lane 1 is Maker DL2000, Lane 2, 3 is fragment 2, Lane 4, 5 is f
图 3-3 重叠 PCR 合成靶点二的 sgRNA 序列Fig.3-3 Overlapping PCR to synthesize sgRNA sequence of target 2图中泳道 1 为 Maker DL2000，泳道 2，3 为片段二，泳道 4，5 为片段一。In the figure, Lane 1 is Maker DL2000, Lane 2, 3 is fragment 2, Lane 4, 5 is fragment 1.图 3-4 pG638 片段三的电泳检测图Fig.3-4 Electrophoretic detection of pG638 fragments 3图中泳道 1 为 Maker DL2000，泳道 2，3，4，5，6 为片段三。In the figure, Lane 1 is Maker DL2000, Lane 2, 3, 4, 5, 6 is fragment 3.
【参考文献】
本文编号：2851863
【学位单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S681.9;Q943.2
【部分图文】：
3.3 结果与分析3.3.1 矮牵牛 miR159a 基因敲除载体的构建以 pUC119-AtU6-gRNA 为模板，使用引物 M13F+159a-sgR1 和 M13R+159a-sgF1 进行第一轮扩增，得到片段一和片段二（如图 3-1），再以片段一和片段二为混合模板，使用引物 M13F+M13R 进行第二轮扩增，胶回收得到片段三（如图 3-2）。用 KpnI 和 XhoI 分别酶切片段三和 pcoCas9 质粒，胶回收目的条带，将片段三的目的片段连接到 pcoCas9 质粒的载体片段上，转化大肠杆菌，PCR验证，将检测出条带的菌液送测，测序正确后命名为 pG638-M。以 T617N-1 为模板，使用引物 M13R+159a-sgR2 和 M13F+159a-sgF2 进行第一轮扩增，得到片段一和片段二（如图 3-3），再以片段一和片段二的混合物为模板，使用引物 M13F+M13R 进行第二轮扩增，胶回收得到片段三（如图 3-4）。用 EcoRI+XbaI 分别酶切片段三和 pG638-M 质粒，将目的片段连接到 pG638-M和质粒的载体片段上，转化大肠杆菌，经 PCR 和凝胶电泳检测验证，测序正确后命名为 pG638（如图 3-5），载体见图如 3-6 所示。
图 3-2 pG638-M 片段三的电泳检测图Fig.3-2 Electrophoretic detection of pG638-M fragments 3图中泳道 1 为 Maker DL2000，泳道 2，3 为片段三。In the figure, Lane 1 is Maker DL2000, Lane 2, 3 is fragment 3.图 3-3 重叠 PCR 合成靶点二的 sgRNA 序列Fig.3-3 Overlapping PCR to synthesize sgRNA sequence of target 2泳道 1 为 Maker DL2000，泳道 2，3 为片段二，泳道 4，5 为片段gure, Lane 1 is Maker DL2000, Lane 2, 3 is fragment 2, Lane 4, 5 is f
图 3-3 重叠 PCR 合成靶点二的 sgRNA 序列Fig.3-3 Overlapping PCR to synthesize sgRNA sequence of target 2图中泳道 1 为 Maker DL2000，泳道 2，3 为片段二，泳道 4，5 为片段一。In the figure, Lane 1 is Maker DL2000, Lane 2, 3 is fragment 2, Lane 4, 5 is fragment 1.图 3-4 pG638 片段三的电泳检测图Fig.3-4 Electrophoretic detection of pG638 fragments 3图中泳道 1 为 Maker DL2000，泳道 2，3，4，5，6 为片段三。In the figure, Lane 1 is Maker DL2000, Lane 2, 3, 4, 5, 6 is fragment 3.
【参考文献】
相关期刊论文 前3条
1 丁伯龙;;矮牵牛的应用与培育[J];中国林业;2012年12期
2 邱勇波;罗凤霞;白瑞琴;张丽;;热胁迫下矮牵牛幼苗的形态和生理变化[J];河北农业大学学报;2008年01期
3 魏跃;王开冻;李洪海;徐贵;;矮牵牛四倍体的诱导及其形态特征[J];江苏农业科学;2007年03期
本文编号：2851863
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/2851863.html
教材专著
