利用SUMO融合技术在大肠杆菌中表达抗菌肽BSN-37

发布时间：2020-10-29 08:54

　　 近年来,随着传统抗生素的不合理使用,致使残留问题日益严重,耐药菌株不断出现。因此,寻找抗生素替代物迫在眉睫。抗菌肽是生物体在抵抗外来微生物入侵时产生的一类防御性小肽,因其独特的优势有望成为抗生素的替代物。由于天然抗菌肽来源有限,从生物体内提取步骤繁琐,获得产量不高;化学合成法虽然可大量获得抗菌肽,但其合成成本相对较高;因此,通过基因工程实现抗菌肽的体外表达是今后的研究重点和发展方向。抗菌肽BSN-37是本实验室具有自主知识产权的牛源抗菌肽,该抗菌肽是由37个氨基酸组成(序列为:FRPPIRRPPIRPPFYPPFRPPIRPPIFPPIRPPFRPP),分子量为3.3 kDa,前期的研究结果发现该抗菌肽具有较好的抗菌活性。为了获得高效的抗菌肽BSN-37,同时克服抗菌肽BSN-37对宿主细菌的破坏作用,本试验采用融合表达的方式,在大肠杆菌中表达具有较好抑菌活性的抗菌肽BSN-37。根据抗菌肽BSN-37的氨基酸序列和大肠杆菌偏爱密码子,反向翻译出其基因片段,合成BSN-37基因,大小为126 bp,并将其克隆至PUC57载体中,命名为PUC-BSN-37。将原核表达载体pGEX-6p-1和目的基因PUC-BSN-37经BamH I和Xho I分别双酶切后,通过T4 DNA连接酶进行连接并转化大肠杆菌DH 5α,构建pGEX-6p-1-BSN-37重组质粒,对重组质粒进行PCR、双酶切以及测序鉴定;将构建好的阳性质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,经SDS-PAGE和Western Blot检测显示:空载体工程菌在26 kDa处有明显的标签蛋白GST的表达,而含有BSN-37的融合蛋白在30 kDa处表达不明显或表达量很低。为了提高抗菌肽BSN-37表达产量,本研究选择了SUMO分子伴侣在大肠杆菌中表达抗菌肽,以PUC-BSN-37为模板,分别设计含有Xho I和Hind III双酶切位点的上下游引物,扩增出目的基因BSN-37;将融合型表达载体pCold-SUMO与目的基因BSN-37经Xho I和Hind III分别双酶切后,通过T4DNA连接酶进行连接并转化大肠杆菌DH 5α,构建pCold-SUMO-BSN-37重组质粒,并对重组质粒进行菌液PCR、双酶切以及测序鉴定。将构建好的阳性质粒pCold-SUMO-BSN-37转化大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,经过对表达条件的优化,摸索出表达的最佳条件。结果显示:终浓度为0.4μM的IPTG在37℃、pH 7.2的条件下诱导6 h,表达效果最好。经SDS-PAGE电泳检测,表达产物是以可溶性形式存在。由于BSN-37的N-端加了His标签,因而利用亲和层析的方法进行目的蛋白的纯化,并通过SDS-PAGE和Western Blot对其表达量进行检测;将纯化后的目的蛋白用SUMO蛋白酶在4℃酶切12 h获得融合蛋白,经过浓缩除盐后再次进行纯化,获得目的蛋白;通过双层琼脂扩散试验对目的蛋白进行活性检测。结果显示:上清液中检测到的目的蛋白约为25 kDa,而标签蛋白大小约为19 kDa,与预期结果相符;酶切后的目的蛋白对沙门氏菌CVCC541具有良好的抑菌活性。综上所述,本研究利用融合技术将抗菌肽BSN-37在大肠杆菌中获得可溶性表达,检测到了相应的抗菌活性,为进一步研究牛源抗菌肽的表达以及开发新型抗菌药物奠定基础。
【学位单位】：河南科技学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q78
【部分图文】：

二硫键存在于两个构成β-折叠的肽段之间，起到稳定抗菌肽结构的作用，有助于抗菌肽穿过细胞膜（图1-1A）。α-螺旋型抗菌肽：含有一个跨膜的α-螺旋结构，其自身或者螺旋结构聚合体介导抗菌肽诱发细菌内容物的泄露，使细菌死亡（图 1-1 B）。线性结构抗菌肽：这类抗菌肽在 C-端有一个分子内二硫键，形成一个环链结构，而N-端则为线性结构（图 1-1 C）。图 1-1 抗菌肽结构分类示意图。A：α-螺旋结构；B：β-折叠结构；C：线性结构Fig 1-1 Structural classes of antimicrobial peptides .A:α-helical peptides; B:β-sheet peptides; C:extended peptides.1.2 抗菌肽的杀菌作用由于人类大量使用抗生素，导致耐药菌株不断出现，对整个社会造成严重的威胁。传统抗生素的杀菌机制是使细菌细胞壁的合成受到阻碍，胞内 ATP 减少之后，细菌不能正常的呼吸而死亡[9]。目前，抗菌肽的杀菌机制有两种，一种为胞外杀菌机制：抗菌肽可以破坏细菌的细胞膜，形成空洞，使细菌死亡。另一种为胞内杀菌机制：抗菌肽破坏细胞膜后，进入菌体内与胞内其他物质结合，导致细菌死亡。其中以胞外杀菌机制的研究最多，主要包括以下四种[10]：（1）“聚集体”模型（图 1-2A）；（2）“环孔”模型（图 1-2B）；（3）“桶板”模型（图 1-2C）；（4）“地毯”模型（图 1-2D）。

图 1-2 抗菌肽作用机制[9]Fig l-2 Action mechanism of antibacterial peptides菌肽的应用前景 1976 年首次成功地在大肠杆菌中表达重组人肽激素生长抑制素以来，究抗菌肽已经成为趋势。在此之前,只能从大量的动、植物组织或生物化少量的蛋白质和酶。然而，随着基因工程的迅速发展，大规模生产蛋。2010 年，保守估计全球食用动物生产中的抗生素消费量为 63 151 吨[1的 30 年里，新抗生素的批准数量快速下降。因此，迫切需要开发新型抗菌.1 抗菌肽在医药方面的应用年来，抗菌肽作为药物载体被广泛地推广，有学者对抗菌肽在维护医疗也进行了相关的研究发现，抗菌肽在医疗应用拥有众多优势，因此，将

SUMO修饰化与去SUMO修饰化
【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 齐玲;王玮瑶;郑中华;张以忠;赵丽微;钟秀宏;赵东海;杨淑艳;杨宁江;任旷;于洪泉;;SUMO及SUMO化修饰蛋白在恶性胶质瘤发生中的作用[J];吉林大学学报(医学版);2016年01期

2 黄禾菁;侯健;;SUMO化修饰与血液系统疾病[J];中国实验血液学杂志;2013年01期

3 马禕文;吕翔;;抑制SUMO特异性蛋白酶1在小鼠急性肺损伤中的保护作用[J];中国临床医学;2015年06期

4 杨红艳;徐锦春;陈思娇;郭英华;张怡舜;梁怡凡;贺诗元;董思雨;何欢;宋今丹;;前列地尔对SUMO介导的2型糖尿病大鼠脑组织病变的作用[J];心血管康复医学杂志;2013年06期

5 马范玲;胡泽文;;基于SUMO本体的图书自动分类模型研究[J];情报杂志;2011年01期

6 徐德智;郑春卉;K. Passi;;基于SUMO的概念语义相似度研究[J];计算机应用;2006年01期

7 赵怡超;卜军;何奔;;SUMO化修饰在核受体功能调控中的作用[J];生理科学进展;2013年04期

8 孙鹏;吉冰洋;龙村;;SUMO化调节在深低温停循环脑保护机制中的研究进展[J];中国体外循环杂志;2013年02期

9 刘世荣;何维;;SUMO化修饰:一种多功能的蛋白质翻译后修饰方式[J];医学分子生物学杂志;2006年03期

10 朱冰冰;王伟铭;陈楠;;SUMO化反应在肾脏疾病中的作用探索[J];国际内科学杂志;2007年12期

相关博士学位论文 前10条

1 孙浩;蛋白激酶C去SUMO化修饰调控甘氨酸受体膜转运[D];上海交通大学;2014年

2 杜彩萍;神经型一氧化氮合酶SUMO化在突触可塑性中的作用[D];南京医科大学;2013年

3 庞琦;TFEB的SUMO化修饰在巨噬泡沫细胞形成中的作用[D];上海交通大学;2015年

4 陈安静;泛素化与类泛素（SUMO）化在甲壳动物免疫反应中的功能[D];山东大学;2013年

5 温冬华;前列腺癌细胞SUMO化蛋白的发现和功能研究[D];上海交通大学;2014年

6 栾超;利用SUMO融合技术在枯草芽孢杆菌中重组表达抗菌肽cathelicidin-BF及其生物学活性研究[D];浙江大学;2014年

7 刘春燕;大豆SUMO系统相关基因挖掘分析及功能研究[D];中国农业科学院;2013年

8 刘晓智;蛋白质SUMO化修饰在低温与高热应激条件下的细胞保护功能研究[D];天津医科大学;2017年

9 柳霖坡;拟南芥SUMO特异蛋白酶基因EL5和EL6调节植物育性的分子机制研究[D];中国农业科学院;2015年

10 任文博;亚低温上调蛋白SUMO化修饰促进BMSCs在缺氧环境中存活[D];天津医科大学;2017年

相关硕士学位论文 前10条

1 董萌萌;利用SUMO融合技术在大肠杆菌中表达抗菌肽BSN-37[D];河南科技学院;2019年

2 张龑;Foxm1的SUMO化对干细胞样细胞的多能性维持基因、信号通路、细胞增殖的影响及其机制[D];西北农林科技大学;2018年

3 郭浩琰;Nrf2的SUMO/去SUMO化修饰在肿瘤代谢和增殖调控中的研究[D];大连医科大学;2018年

4 李艳君;大豆SUMO系统在盐、高温和ABA胁迫下的表达分析与底物预测[D];东北农业大学;2018年

5 张婷玉;基于SUMO仿真的典型城市信号交叉口改进方案及其评价[D];长安大学;2014年

6 李启峰;类泛素蛋白SUMO在布鲁氏菌感染小鼠巨噬细胞过程中的作用研究[D];石河子大学;2016年

7 周旋;酵母SUMO和SUMO蛋白酶在大肠杆菌中的高效表达[D];安徽农业大学;2016年

8 郝思静;血管内皮中SUMO化修饰在动脉粥样硬化中的作用和机制研究[D];浙江大学;2016年

9 王云谦;基于SUMO车载自组织网络路由协议的研究与实现[D];南京邮电大学;2015年

10 赵波;SUMO化修饰对磷酸化CRMP2介导树突棘可塑性的影响[D];暨南大学;2017年

本文编号：2860670