马铃薯StLOR基因家族鉴定和StLOR7基因功能研究

发布时间：2020-10-29 16:43

　　 寄生霜霉菌响应迟发上调基因(Late up-regulated in response to Hyaloperonospora pa rasitica,LURP1)属于LOR基因家族,在植物抵御卵菌属(Oomycetes)病原菌的反应和抗逆中起到关键作用。目前,对LURP1基因功能的研究仍不完善,且多局限于模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)中,其在马铃薯(Solanum tuberosum L.)中的研究尚未见报道。此外,迄今还没有在任何物种中进行LOR基因家族系统鉴定的报道。本实验室的前期实验中发现一个功能未知、但能与脱水响应元件(Dehydration responsive element,DRE)相互作用的基因,经本地序列基本搜索工具(Basic loocal alignment search tool,BLAST)比对,该基因为马铃薯StLURP1。本研究通过生物信息学手段在基因组水平上鉴定了马铃薯StLOR基因家族,同时重点关注与DRE元件相互作用的基因StLOR7。为了阐明马铃薯StLOR7基因的生物学功能、明确其在蛋白互作网络中的作用和其亚细胞定位情况,本研究构建了过表达载体pBI121-StLOR7,并转化马铃薯四倍体栽培品种“大西洋”;利用同源重组的定向克隆方式构建了酵母(Saccharomyces cerevisiae)双杂交系统(Yeast two-hybrid system)诱饵载体pGBKT7-StLOR7,并筛选马铃薯cDNA文库。取得的主要结果如下:1.鉴定出马铃薯StLOR基因家族中16个含有完整开放阅读框和LOR结构域的成员,根据它们的染色体分布将其重新命名为StLOR1-16;明确了StLORs的理化性质、基因结构、蛋白基序、在种内及种间的系统发育情况;在StLORs的上游启动子区发现了多种与胁迫和激素相关的顺式作用元件,暗示该家族能够广泛地响应胁迫和植物激素处理;进行了基于公共转录组数据的StLOR基因家族在马铃薯不同组织中的分布情况和在不同胁迫及激素处理下的表达模式分析,发现StLOR基因家族成员在马铃薯不同组织中的分布具有特异性;此外,两个StLOR成员能响应热胁迫(3、9);三个成员能响应GA_3处理(1、2、12);StLOR11、12和StLOR1、2能够分别响应BAP和ABA处理;BABA处理时,StLOR14、15的表达量显著升高,同时StLOR4、8、16下调;StLOR5专一地响应机械损伤。但StLORs的表达似乎不能被盐和渗透胁迫诱导。2.通过实时定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检验了StLOR基因家族16个成员在4种胁迫(渗透、干旱、冷、热胁迫)及4种及激素(赤霉素、脱落酸、水杨酸和茉莉酸甲酯)处理下的表达模式。其中除StLOR13、14外,其余家族成员都能响应盐胁迫处理;StLOR2和StLOR13专一性地分别受盐胁迫和冷胁迫诱导;StLOR4、StLOR6和StLOR7受脱落酸的诱导;StLOR1、3、5、15、16能响应多种不同激素处理;StLOR8受热胁迫诱导。本研究同时考察了StLOR7的相对表达量在上述8种处理下随时间变化的趋势,发现StLOR7仅能微弱地响应热胁迫、干旱胁迫和水杨酸处理,但其受到GA_3、MeJA和盐胁迫的强烈诱导,其表达量在24 h时极显著上调,在48 h处达到最大值。3.构建了由CaMV 35S启动子驱动的过表达载体pBI121-StLOR7,并通过薯片转化法转化马铃薯四倍体栽培品种“大西洋”。经过新霉素磷酸转移酶基因NPT II的PCR检验和qRT-PCR检验,StLOR7已成功插入转基因植株的基因组中。4.本研究克隆了StLOR7基因的CDS区,并通过同源重组的定向克隆方式构建了酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-StLOR7。利用酵母的接合生殖使诱饵蛋白与cDNA文库杂交并涂布高严谨筛选培养基,筛选得到126个候选阳性克隆,其中有88个单克隆能在染色筛选中水解显色底物X-α-Gal,阳性率接近70%。经测序得到含正确开放阅读框的StLOR7互作蛋白12种,包括DnaJ家族蛋白、甘油磷酸二酯酶、多酚氧化酶、富脯氨酸蛋白、肌动蛋白解聚因子、重金属转运蛋白等。互作蛋白的基因本体论(Gene Ontology,GO)注释分析暗示StLOR7可能参与植物病原防御、胁迫响应、重金属解毒、微丝运动、脂类代谢、蛋白质折叠与磷酸化等重要生物过程。初步明确了StLOR7蛋白的互作网络关系。
【学位单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q943.2;S532
【部分图文】：

图 1.1 植物响应胁迫的分子机制[3]Fig. 1.1 Molecular mechanism of plant response to stresses[3]例如在拟南芥中，热休克蛋白(Heat Shock Proteins, HSPs)基因在植物受到生物胁迫、、盐、热和渗透胁迫时上调表达，但在线虫病侵染和干旱的共同作用下下调[10-14]；衰关基因(Senescence-related genes)受热和干旱胁迫的共同作用及病毒侵染的诱导[15,19]；相关蛋白(Pathogenesis-related proteins, PRS)在植物同时被病毒侵染和受热胁迫时下调[15]；过氧化物酶(Peroxidase，POD)在植物受到冷、干旱、生物胁迫时表达量降低[17,18]生物合成基因(Ethylene biosynthesis genes)受到干旱、冷和盐胁迫的诱导[19]；植物体内A 的含量在干旱、冷、盐和渗透胁迫下增加等[16]。2010 年，Mantri 等分析了鹰嘴豆对、寒冷、高盐和坏死性真菌病原菌 Ascochyta rabiei 的反应。结果表明，51 个基因能应 A. rabiei 而差异表达，其中 21 种基因同时受到 A. rabiei 和一种或多种非生物胁迫导，但没有任何一个基因能同时响应以上四种胁迫[20]。2013 年，Massa 等使用 RNA-Se铃薯(Solanumtuberosum L.)进行了深入的转录组分析，以研究马铃薯响应生物胁迫[马

甘肃农业大学 2019 届硕士学位论文的负调节因子起作用[75]。而，除了 LOR 的第一个成员 LURP1 之外，LOR 基因家族中的其他成员没有病原防御相关的表达模式，这意味着它们的功能仍然是未知的[63]。本研究的目的和意义前，对 LURP1 基因功能的研究仍不完善，且多局限于模式植物拟南芥中，的研究尚未见报道。此外，迄今还没有在任何物种中进行 LOR 基因家族系统在这项研究中，我们在基因组水平上鉴定了马铃薯 StLOR 基因家族，同时重E 元件相互作用的基因 StLOR7，通过生物信息学分析、遗传转化、酵母双杂对该基因进行研究，以期明确其基因功能和在蛋白互作网络中的位置。技术路线

甘肃农业大学 2019 届硕士学位论文StLOR15-StLOR16 在 12 号染色体上形成 Cluster B。StLOR基因及其编码蛋白的详细信息列在表 2.2 中。预测的StLOR 蛋白长度范围为127个氨基酸(StLOR16)至 235 个氨基酸(StLOR8)，意味着该基因家族成员之间存在结构差异和功能多样性。除 StLOR1(5.17)和 StLOR12(6.17)外，其他蛋白质的理论 pI 均大于 7，为碱性蛋白，但 pI 变化较大，表明它们可能存在于细胞的不同分域中。亲水平均值(GRAVY)的预测结果显示这些蛋白质大多数是亲水的。StLOR4、5、7、8 和 StLOR15 分别位于叶绿体和线粒体中，而 StLOR14 可能参与分泌途径。根据预测结果，仅有 StLOR3 中存在一个跨膜结构域(未列出)，StLOR 基因家族成员均不含信号肽。
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1 房宸曦;马铃薯StLOR基因家族鉴定和StLOR7基因功能研究[D];甘肃农业大学;2019年

本文编号：2861176