橙花龙胆二氢黄酮醇4-还原酶（DFR）基因的功能分析

发布时间：2020-10-30 00:59

　　 花色是决定花卉观赏价值和商业价值的重要因素,而花青素苷是影响植物花色的重要因素。二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)基因是花青素生物合成途径中的一个关键基因,编码的DFR催化二氢堪非醇(dihydrokaempferol,DHK),二氢杨梅黄酮(dihydromyriceti,DHM),二氢栎皮黄酮(dihydroquercetin,DHQ)三种黄烷酮生成的无色花青素是花青素和原花青素的前体物质。因此,DFR在高等植物花色的形成过程中发挥极其重要的作用,是形成花青素苷的一个非常重要的调控点。本实验室从橙花龙胆(Gentiana lutea L.var.aurantiaca)花瓣中克隆得到了GlaDFR1和GlaDFR2两个基因。序列分析结果表明,两个基因均具有完整的开放阅读框,编码374个氨基酸,均有NADP(H)和底物结合域,属于NADP(H)依赖性短链还原酶(SDR)家族成员,GlaDFR1和GlaDFR2均为Asp型DFR。为了研究GlaDFR1和GlaDFR2的功能,分别构建在CaMV35S启动子驱动下的GlaDFR1和GlaDFR2基因表达载体pCAMBIA1302-GlaDFR1和pCAMBIA1302-GlaDFR2。将这两个表达载体分别转化入根癌农杆菌EHA105,利用叶盘法转化烟草,获得转基因植株。通过潮霉素抗性筛选获得T1代植株,对其进行分子检测和表型观察。提取T1代转基因烟草植株基因组DNA进行PCR检测,结果表明GlaDFR1和GlaDFR2成功插入转基因烟草植株的基因组中。采用半定量RT-PCR技术检测外源基因在转录水平上的表达情况,结果表明GlaDFR1和GlaDFR2基因均在转录水平上获得表达。通过观察,转基因植株的花瓣表型出现差异,野生型烟草花瓣颜色为粉红色,过表达GlaDFR1和GlaDFR2的转基因植株花瓣颜色偏红,利用高效液相色谱技术(HPLC)检测花青素苷含量,与野生型烟草进行对比,矢车菊色素衍生物的含量均降低,初步证明GlaDFR1和GlaDFR2具有二氢黄酮醇还原酶的功能,参与橙花龙胆花青素的合成。
【学位单位】：长春师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q943.2
【部分图文】：

常见的花

形成堪非醇（Kaempferol）、槲皮素（Quercetin）和杨梅素（Myrice 与 DFR 竞争二氢黄酮醇作为其酶的底物（图 1.2）[12, 34]。在花青素合用下，三种无色花青素转化成花青素，最终使植物呈现出不同的颜胞质和液泡中，花青素糖基转移酶（GT）将花青素再转变为花青素对植物的花色及花青素的稳定性和可溶性有着重要的作用其原因在基化的位置。Lou 等研究指出麝香兰（Muscari）的 DFR 主要催化 DHM，因此[35]，而草莓的 DFR 以催化 DHK 为主，因此果实为红色[36]。此外DFR 功能的缺失会使植物的组织或器官的颜色变浅或者呈现无色物基因工程来改变植物组织或器官的颜色许多都围绕 DFR 开展工

在本实验中以橙花龙胆花瓣 DFR 基因为研究对象，研究 DFR 基因的功能，揭示DFR底物特异性的分子机制以及拓宽应用DFR基因在植物基因工程中的应奠定理论基础。技术路线：
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本文编号：2861734