白桦SPL3,9,10基因克隆及功能鉴定
发布时间：2020-10-30 00:26
白桦(Betula platyphylla Suk.)是中国北方重要的林木树种之一,单性花,雌雄同株,具有重要的研究价值。SPL(SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE)转录因子是植物特有的基因家族,广泛存在于绿色植物中,它在调控叶片发育、花和果实发育、育性等方面起重要作用。本实验首先通过基因组数据库的信息,从白桦中克隆到BpSPL3、BpSPL9和BpSPL10基因的ORF序列,并构建相应过表达载体和抑制表达载体,分别命名为:35::BpSPL3-GFP、35S::BpSPL9-GFP、35S::BpSPL10-GFP、35S::BpSPL3-RNAi、35S::BpSPL9-RNAi 和 35S::BpSPL10-RNAi。同时通过双酶切的方法克隆出起始密码子上游2000bp的启动子序列并构建带有GUS标签的表达载体,依次命名为 BpSPL3::GUS,BpSPL9::GUS,BpSPL10::GUS。对BpSPL3、BpSPL9和BpSPL10基因的启动子进行顺式作用元件预测,发现上述基因的启动子序列除含有核心启动子元件外,还含有光响应作用元件,激素类相应元件,非生物胁迫类响应元件等。通过农杆菌介导的方法将BpSPL3::GUS表达载体瞬时转化至白桦以及蘸花法稳定遗传转化至拟南芥中,结果显示BpSPL3启动子在白桦中的叶片毛状体、茎、芽和根上有高度表达;在拟南芥中的新叶毛状体、老叶的叶边缘处、侧根和雌蕊柱头中有较高的GUS表达活性。通过亚细胞定位的方法发现BpSPL3基因特异性定位于细胞核中。农杆菌介导的方法遗传转化获得BpSPL3基因的转基因株系。通过对的转基因株系分析发现BpSPL3过表达转基因植株根长变短,莲座叶数量显著减少,初级茎数量增加,角果长度及数量减少,同时发现过表达BpSPL3转基因株系四轮花器官均显著减小。实时荧光定量分析PNY、LFY、LBD10和LBD27基因在转基因植株花序中的表达量水平,结果显示表达量均提高2-4倍不等。表明在过表达BpSPL3转基因拟南芥中,PNY、LFY、LBD10和LBD27基因可能直接或间接参与花发育,并受BpSPL3基因的调节。
【学位单位】：东北林业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q943.2;S792.153
【部分图文】：
通过ＣＴＡＢ法提取白桦组培苗叶片总ＲＮＡ，反转录合成ｃＤＮＡ后，使用引物扩增??和川基因的ＯＲＦ序列，菌液ＰＣＲ结果显示分别在１４３７ｂｐ，??１１３４ｂｐ，?１４４６ｂｐ处有符合目的片段大小的单一目的条带（图２－１）。将胶回收后的目的??片段与Ｔ载体连接，热激法转化大肠杆菌，菌液ＰＣＲ检测，检测结果表明ＰＣＲ扩增出??的阳性条带符合目的片段大小（图２－２），随机挑选２－３个阳性菌液送公司测序，比对??结果显示序列正确，结果表明５ｐＳＰｉ：３、和川基因Ｔ载体构建成功。??＾＞ＳＰＬ３?ＢｐＳＰＬ９?ＢｐＳＰｔＷ??－?ｊＭ??ｌ０００ｂＰ??■?■?■??图２－１办ＳＰＺＪ、、办尸基因克隆??Ｙｉｇ．２－＼?Ｃｌｏｎｉｎｇ?ｏｆ?ＢｐＳＰＬ３、ＢｐＳＰＬ９、ＢｐＳＰＬＩＯ?ｇｅｎｅ??－１２－??
通过ＣＴＡＢ法提取白桦组培苗叶片总ＲＮＡ，反转录合成ｃＤＮＡ后，使用引物扩增??和川基因的ＯＲＦ序列，菌液ＰＣＲ结果显示分别在１４３７ｂｐ，??１１３４ｂｐ，?１４４６ｂｐ处有符合目的片段大小的单一目的条带（图２－１）。将胶回收后的目的??片段与Ｔ载体连接，热激法转化大肠杆菌，菌液ＰＣＲ检测，检测结果表明ＰＣＲ扩增出??的阳性条带符合目的片段大小（图２－２），随机挑选２－３个阳性菌液送公司测序，比对??结果显示序列正确，结果表明５ｐＳＰｉ：３、和川基因Ｔ载体构建成功。??＾＞ＳＰＬ３?ＢｐＳＰＬ９?ＢｐＳＰｔＷ??－?ｊＭ??ｌ０００ｂＰ??■?■?■??图２－１办ＳＰＺＪ、、办尸基因克隆??Ｙｉｇ．２－＼?Ｃｌｏｎｉｎｇ?ｏｆ?ＢｐＳＰＬ３、ＢｐＳＰＬ９、ＢｐＳＰＬＩＯ?ｇｅｎｅ??－１２－??
（四）ＢｐＳＰＬ３，?ＢｐＳＰＬ９，?ＢｐＳＰＬＩＯ蛋白质亲疏水性分析??蛋白质的亲疏水性是决定蛋白质空间结构的因素之一，一定程度上决定了蛋白的折??方式，因此在蛋白的特定功能上起着重要作用。我们使用ｐｒｏｔｓｃａｌｅ在线软件对??ｐＳＰＬ３、ＢｐＳＰＬ９和ＢｐＳＰＬＩＯ的氨基酸序列进行亲疏水性分析。小于零部分大于５０％??亲水性蛋白，大于零部分大于５０％为疏水性蛋白，结果表明ＢｐＳＰＬ３，ＢｐＳＰＬ９，??ｐＳＰＬＩＯ的蛋白质均为亲水性蛋白（图２－５）。??－１５－??
【参考文献】
本文编号：2861689
【学位单位】：东北林业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q943.2;S792.153
【部分图文】：
通过ＣＴＡＢ法提取白桦组培苗叶片总ＲＮＡ，反转录合成ｃＤＮＡ后，使用引物扩增??和川基因的ＯＲＦ序列，菌液ＰＣＲ结果显示分别在１４３７ｂｐ，??１１３４ｂｐ，?１４４６ｂｐ处有符合目的片段大小的单一目的条带（图２－１）。将胶回收后的目的??片段与Ｔ载体连接，热激法转化大肠杆菌，菌液ＰＣＲ检测，检测结果表明ＰＣＲ扩增出??的阳性条带符合目的片段大小（图２－２），随机挑选２－３个阳性菌液送公司测序，比对??结果显示序列正确，结果表明５ｐＳＰｉ：３、和川基因Ｔ载体构建成功。??＾＞ＳＰＬ３?ＢｐＳＰＬ９?ＢｐＳＰｔＷ??－?ｊＭ??ｌ０００ｂＰ??■?■?■??图２－１办ＳＰＺＪ、、办尸基因克隆??Ｙｉｇ．２－＼?Ｃｌｏｎｉｎｇ?ｏｆ?ＢｐＳＰＬ３、ＢｐＳＰＬ９、ＢｐＳＰＬＩＯ?ｇｅｎｅ??－１２－??
通过ＣＴＡＢ法提取白桦组培苗叶片总ＲＮＡ，反转录合成ｃＤＮＡ后，使用引物扩增??和川基因的ＯＲＦ序列，菌液ＰＣＲ结果显示分别在１４３７ｂｐ，??１１３４ｂｐ，?１４４６ｂｐ处有符合目的片段大小的单一目的条带（图２－１）。将胶回收后的目的??片段与Ｔ载体连接，热激法转化大肠杆菌，菌液ＰＣＲ检测，检测结果表明ＰＣＲ扩增出??的阳性条带符合目的片段大小（图２－２），随机挑选２－３个阳性菌液送公司测序，比对??结果显示序列正确，结果表明５ｐＳＰｉ：３、和川基因Ｔ载体构建成功。??＾＞ＳＰＬ３?ＢｐＳＰＬ９?ＢｐＳＰｔＷ??－?ｊＭ??ｌ０００ｂＰ??■?■?■??图２－１办ＳＰＺＪ、、办尸基因克隆??Ｙｉｇ．２－＼?Ｃｌｏｎｉｎｇ?ｏｆ?ＢｐＳＰＬ３、ＢｐＳＰＬ９、ＢｐＳＰＬＩＯ?ｇｅｎｅ??－１２－??
（四）ＢｐＳＰＬ３，?ＢｐＳＰＬ９，?ＢｐＳＰＬＩＯ蛋白质亲疏水性分析??蛋白质的亲疏水性是决定蛋白质空间结构的因素之一，一定程度上决定了蛋白的折??方式，因此在蛋白的特定功能上起着重要作用。我们使用ｐｒｏｔｓｃａｌｅ在线软件对??ｐＳＰＬ３、ＢｐＳＰＬ９和ＢｐＳＰＬＩＯ的氨基酸序列进行亲疏水性分析。小于零部分大于５０％??亲水性蛋白，大于零部分大于５０％为疏水性蛋白，结果表明ＢｐＳＰＬ３，ＢｐＳＰＬ９，??ｐＳＰＬＩＯ的蛋白质均为亲水性蛋白（图２－５）。??－１５－??
【参考文献】
相关硕士学位论文 前2条
1 刘闯;18个白桦SPLs基因的鉴定及BpSPL8基因的功能分析[D];东北林业大学;2017年
2 官民晓;白桦雌雄花序转录组分析及SEP1基因的功能鉴定[D];东北林业大学;2013年
本文编号：2861689
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