秀丽线虫SET-18调控线粒体和内质网未折叠蛋白压力应答的研究

发布时间：2020-10-31 04:11

　　 细胞受到病毒感染,氧化损伤等应激时,导致细胞内积累大量的错误折叠或未折叠蛋白质。为了维持细胞内的蛋白稳态,细胞通过增强蛋白折叠、加速未折叠蛋白质的降解等方式清除未折叠的蛋白质,该过程被称为未折叠蛋白压力应答(unfolded protein response,UPR)。该应答过程主要发生在线粒体和内质网两个细胞器,分别为线粒体和内质网未折叠蛋白压力应答,即UPR~(mt)和UPR~(ER)。已有研究发现,UPR~(mt)和UPR~(ER)能力与生物体衰老密切相关。在生物体衰老进程中,UPR~(mt)或者UPR~(ER)的应答能力发生下降。而激活秀丽线虫UPR~(mt)或者UPR~(ER)能够延长线虫的寿命。秀丽线虫是研究衰老调控的经典模式生物之一。本实验室已有的研究发现,具有组蛋白H3K36二甲基转移酶活性的SET-18,通过与哺乳动物高度保守的Insulin/IGF-1信号通路促进线虫衰老。SET-18通过对该信号通路中的FOXO转录因子daf-16a的启动子进行H3K36me2修饰,抑制了daf-16a转录,从而加速了衰老进程。但是SET-18对衰老的促进作用是通过调控何种细胞活动而实现的,目前仍不清楚。由于SET-18主要在线虫肌肉特异性表达,而肌肉是相应UPR~(mt)和UPR~(ER)的重要场所。另外有研究发现,与SET-18同源的哺乳动物中SMYD1基因参与UPR~(ER)反应。因此,本论文将就SET-18是否调控UPR~(mt)和UPR~(ER)进行探讨。HSP-6和HSP-60是应答UPR~(mt)的主要标记基因。我们首先利用杂交技术,构建了带有hsp-6::GFP和hsp-60::GFP的set-18(gk334)突变体线虫。经基因型鉴定构建成功后,通过荧光显微镜观察发现,set-18基因缺失不影响HSP-6和HSP-60的表达水平。在通过RNAi抑制细胞色素C氧化酶cco-1而诱发UPR~(mt)的情况下,野生型线虫N2和set-18(gk334)突变体线虫中HSP-6和HSP-60的表达水平仍然接近。由此说明,SET-18不参与UPR~(mt)过程的调控。HSP-4是应答UPR~(ER)的主要标记基因。我们通过杂交技术和基因型鉴定,首先成功构建了带有hsp-4::GFP的set-18(gk334)突变体线虫,然后我们分别对带有该GFP标签的野生型N2和set-18(gk334)突变体线虫进行热激和衣霉素(tunicamycin,TM)处理以激活UPR~(ER)。我们发现,day 1时期(成虫第一天)的N2线虫在热激和TM处理后,HSP-4的表达水平明显提高。但是day 1时期的set-18(gk334)突变体线虫中,热激和TM处理和未处理,HSP-4的表达水平没有明显变化。这说明,set-18基因缺失影响了UPR~(ER)应答的过程。另外,我们又检测了线虫衰老进程,即从成虫第三天到第11天,set-18(gk334)突变体线虫应答UPR~(ER)的情况。我们发现,随着衰老进程,野生型N2线虫应答由TM诱导的UPR~(ER)的能力逐渐减弱。但对于不同衰老程度(day 1、day 3、day7、day 11)的set-18(gk334)突变体线虫,TM处理都不能激活HSP-4的表达。这说明SET-18对UPR~(ER)的调控并不随着衰老进程而发生变化。另外,我们在set-18(gk334)突变体线虫针对SET-18的靶基因daf-16进行RNAi处理,发现daf-16RNAi并不影响set-18基因缺失对UPR~(ER)应答的影响。以上研究表明,组蛋白H3K36me2甲基转移酶SET-18,参与UPR~(ER)调控过程,但不参与UPR~(mt)调控。另外,SET-18对UPR~(ER)的调控不随着衰老而发生改变,且不依赖DAF-16的活性。该研究为进一步探讨组蛋白H3K36me2修饰促进衰老的细胞学机制奠定了一定的基础。
【学位单位】：东北师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q75
【部分图文】：

也会启动 UPRmt[3]。.线粒体未折叠蛋白压力应答（UPRmt）的调控秀丽线虫为模型进行的 UPRmt相关研究为 UPRmt的调控机制提供了重研究发现，线虫中 ATFS-1（activating transcription factor associatedress-1）是具有亮氨酸拉链（basic leucine zipper domain，bZIP）结构的转当发生 UPRmt时，主要是由 ATFS-1 调控的。ATFS-1 的 N 端含有向线的信号序列 MTS（mitochondrial targeting sequence），其 C 端含有向细的信号序列 NLS（nuclear localization signal）。线粒体在受到未折叠蛋况下，ATFS-1 向线粒体转运的途径受到影响，造成 ATFS-1 堆积在细胞后经由其 C 端的 NLS 序列转运到细胞核中（图 1.1）。ATFS-1 入核后5（ubiquitin-like protein 5）及 DVE-1（defective proventriculus protein 1）复合物，并与核 DNA 结合，诱导线粒体的分子伴侣和蛋白酶等基因热休克蛋白 HSP60 和 HSP6 的转录[4,21-23]。

多肽可以通过 HAF-1 转运到内膜间隙中。当 ClpP 或 HAF-1 基因功能障碍，则导致UPRmt通路信号减弱。另外，UPRmt的激活可诱导UBL-5（ubiquitin-like protein5）基因的转录，UBL-5 与 DVE-1（defective proventriculus protein 1）结合形成的复合物可以调控线粒体分子伴侣的表达。DVE-1 定位于核仁，当发生 UPRmt时，DVE-1 结合到线粒体分子伴侣基因的启动子上，调控基因的表达，促进线粒体热休克蛋白 HSP60 基因的表达[3,17,23,24]（图 1.2）。

图 1.3 哺乳动物调控 UPRER信号通路，引自 Senft D,Ronai Z EA[39]二、生物体衰老的调控（一）衰老的标志衰老是生物体必须经历的生理过程，衰老的机体或细胞对各种外界或内部的的抵抗能力都随着衰老而降低。作为生物体内较为复杂的生理过程，衰老的受到许多因素的调控，包括体内的调控衰老的信号通路中基因突变和染色体常改变，以及外界环境的改变[40]。衰老标志分为三类[40]。第一类标志是被认为是造成细胞损伤的主要原因，基因组不稳定、表观遗传改变、端粒长度消减、蛋白质稳态失衡导致。第二志对于轻度的细胞损伤是有抵抗能力的，可以使细胞恢复功能。包括营养感调、细胞衰老、线粒体功能发生障碍。但是细胞损害程度较为严重或者持续长，那么这类将对细胞产生伤害。第三类标志是干细胞耗竭和细胞间通讯改图 1.4），这类标志是由于前两类导致的最终结果，造成衰老相关的功能衰退
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本文编号：2863428