桂花OfSVP和扩张蛋白基因在开花过程中的作用

发布时间：2020-10-31 15:00

　　 桂花(Osmanthus fragrans)具有较为特殊的开花过程和机制,成花转变、花芽分化和花开放均受到环境温度的影响。环境相对低温能够显著促进桂花花芽分化进程,同时也调控花开放过程。观察了不同温度处理(25℃和19℃)对‘堰虹桂’花芽分化进程的影响,克隆得到7个SVP基因,并分析了这7个SVP基因及其4个下游相关基因在花芽分化进程中的表达模式,探究相对低温影响花芽分化的机制以及SVP基因的作用;同时,分析3个扩展蛋白基因OfEXPLA1、OfEXPA2和OfEXPA4的功能和作用,以明确其在相对低温调控花开放中的作用机制。主要研究结果如下:1.相对低温对花芽分化进程的影响:在不同温度处理(25℃和19℃)中,相对低温处理(19℃)可使‘堰虹桂’提前进入花芽分化,并且能加快整个花芽分化进程。其中受到相对低温影响最为显著的是花序分化期和雌蕊分化期,花序分化期缩短18 d,雌蕊分化期缩短26 d。2.OfSVP基因的克隆及其表达模式分析:从桂花中克隆得到7个SVP基因,ORF finder在线分析发现4个基因(OfSVP1,OfSVP3,OfSVP4,OfSVP5)具有完整的cDNA序列,OfSVP2、OfSVP6和OfSVP7基因5′端存在缺失。7个SVP基因氨基酸序列进行比对分析,OfSVPs具有SVP的主要保守特征,包括N端含有MADS-box、K-box和I-box基序,以及不保守C末端,系统进化树分析表明7个OfSVP基因分别属于2个亚族。对7个SVP基因和其他4个SVP下游基因进行荧光定量表达分析,OfSVP4/6/7在花芽分化过程中在相对低温条件下下调表达,而OfSVP1上调表达,OfSVP2/3/5的表达量在不同温度下没有显著差异。FT、SOC1和GA20ox2在19℃处理下的表达量基本上高于25℃处理,与OfSVP4/6/7表达呈显著负相关。OfSVP4/6/7说明可能响应低温促进花芽分化,其可能通过调控FT、SOC1以及GA20ox2而影响花芽分化进程。3.扩张蛋白OfEXPLA1、OfEXPA2和OfEXPA4的功能分析:构建得到3个35S::OfEXPLA1-GFP、35S::OfEXPA2-GFP和35S::OfEXPA4-GFP重组植物表达载体,然后转入洋葱表皮细胞内,发现OfEXPLA1、OfEXPA2和OfEXPA4蛋白的绿色荧光信号都定位在细胞壁上。通过改进后的花序侵染法获得转桂花OfEXP基因启动子的拟南芥株系,通过表型观察发现3种转基因株系的叶片平均长度和平均宽度都长于野生型,OfEXPLA1和OfEXPA4启动子转基因拟南芥株系的平均花序长度长于野生型,其花序数量也多于野生型。OfEXPA2启动子转基因拟南芥株系的花序长度和数量与野生型比较,没有显著差异。
【学位单位】：浙江农林大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S685.13;Q943.2
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
前言
1 文献综述
    1.1 花芽分化的研究进展
        1.1.1 不同植物中花芽分化的研究
        1.1.2 环境温度调控植物花芽分化的研究
    1.2 SVP的功能和作用
        1.2.1 不同植物SVP家族及功能研究
        1.2.2 SVP响应环境温度以调控植物开花的研究
    1.3 扩展蛋白在开花过程中的作用
        1.3.1 扩展蛋白的基本功能
        1.3.2 扩展蛋白对植物开花的影响
    1.4 目的与意义
2 相对低温对桂花花芽分化进程的影响
    2.1 试验材料
    2.2 试验方法
        2.2.1 低温处理方法
        2.2.2 花芽取样
        2.2.3 石蜡切片制作与观察
    2.3 结果与分析
        2.3.1 相对低温处理对桂花花芽分化过程的影响
    2.4 讨论
3 桂花OfSVP基因的克隆和序列分析
    3.1 试验材料
    3.2 试剂
    3.3 实验方法
        3.3.1 引物设计
        3.3.2 样品采集与保存
        3.3.3 桂花花芽RNA的提取
        3.3.4 RNA反转录cDNA
        3.3.5 PCR反应体系及程序
        3.3.6 目的片段回收
        3.3.7 pMD18-T载体连接
        3.3.8 LB培养基配置
        3.3.9 重组质粒转化大肠杆菌
        3.3.10 挑菌及公司测序
        3.3.11 桂花OfSVP序列分析
        3.3.12 桂花OfSVP蛋白质分析预测
        3.3.13 桂花OfSVP氨基酸系统进化树的构建
    3.4 结果与分析
        3.4.1 桂花OfSVP基因的克隆
        3.4.2 桂花SVP基因的氨基酸基本理化性质分析
        3.4.3 桂花SVP基因的氨基酸序列比对分析
        3.4.4 桂花SVP基因的系统发育进化树分析
    3.5 讨论
4 不同温度条件下OfSVP基因及其他下游基因的表达分析
    4.1 试验材料
    4.2 试验试剂
    4.3 试验方法
        4.3.1 桂花花芽RNA的提取
        4.3.2 荧光定量表达分析
    4.4 结果与分析
        4.4.1 不同温度处理下OfSVPs基因在花芽分化进程中的表达
        4.4.2 不同温度处理下其他OfSVP下游基因在花芽分化进程中的表达
    4.5 讨论
5 桂花扩展蛋白基因的亚细胞定位
    5.1 试验材料
    5.2 主要试剂
    5.3 实验方法
        5.3.1 设计引物
        5.3.2 RNA的提取
        5.3.3 cDNA的反转录
        5.3.4 PCR扩增
        5.3.5 回收目的片段
        5.3.6 目的片段的双酶切
        5.3.7 pCAMBIA1301-35S-GFP表达载体质粒的双酶切
        5.3.8 pCAMBIA1301-35S-GFP载体的连接
        5.3.9 连接产物转化大肠杆菌
        5.3.10 挑菌及测序
        5.3.11 质粒提取
        5.3.12 根癌农杆菌GV3101 感受态细胞的制备
        5.3.13 冻融法转化农杆菌
        5.3.14 农杆菌浸润
    5.4 结果与分析
        5.4.1 植物表达载体的构建及转化农杆菌结果
        5.4.2 扩展蛋白的亚细胞定位情况
    5.5 讨论
6 桂花OfEXP基因启动子转化拟南芥分析
    6.1 实验材料
    6.2 主要试剂
    6.3 实验方法
        6.3.1 拟南芥材料的准备
        6.3.2 农杆菌的准备
        6.3.3 转化拟南芥植株
        6.3.4 种子采收
        6.3.5 转基因拟南芥的筛选
        6.3.6 转基因拟南芥DNA提取
        6.3.7 转基因拟南芥PCR检测
        6.3.8 转基因拟南芥T2 代的检测
        6.3.9 转基因拟南芥T2 代叶片观察
    6.4 结果与分析
        6.4.1 OfEXPLA1、OfEXPA2和OfEXPA4 启动子转化拟南芥的功能分析
    6.5 讨论
7 主要结论与展望
    7.1 主要结论
    7.2 展望
个人简介
致谢

【参考文献】

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本文编号：2864105