溶藻菌Bacillus licheniformis Sp34及其溶藻物质的溶藻特性与机制研究

发布时间：2020-11-06 00:25

　　 水体富营养化和蓝藻水华的发生是全球面临的重大环境问题之一。全球范围内蓝藻水华的爆发频率和强度日益增加,造成水体生态系统结构和功能的破坏和紊乱,降低水资源可利用性,影响旅游,养殖等行业的健康发展,也严重威胁人类的健康和生活。细菌在水生生态系统中具有十分重要的作用,是水环境中生物种群结构和功能的组成部分,与藻类生物量的平衡密切相关。因此,溶藻细菌成为微生物控藻研究的热点。滇池是中国最大的高原湖泊,具有非常重要的生态意义和经济意义,但近年来频繁遭受蓝藻水华的危害。因此,本研究以滇池水华藻为研究对象,研究溶藻菌及其分泌的溶藻物质的溶藻特性与溶藻作用机制,从而为滇池蓝藻水华的防治提供优质的控藻细菌或物质资源和理论指导。主要结果如下:1.溶藻细菌的分离和鉴定。从滇池分离得到了1株高效溶藻细菌Sp34,根据其16S rRNA基因序列及系统发育树分析,Sp34属于Bacillus licheniformis。2.Bacillus licheniformis Sp34对同样分离自滇池的铜绿微囊藻DCM4溶藻特性研究。菌株Bacillus licheniformis Sp34对初始叶绿素a浓度为2 mg/L的铜绿微囊藻的六天去除率为76%,Sp34的最低初始抑藻浓度为1.35×10~5 CFU/mL,另外对铜绿微囊藻NIES843的溶藻作用也能达到97%,表明其能高效的杀灭铜绿微囊藻。而铜绿微囊藻是一种最常见水华蓝藻优势种,其能产生微囊藻毒素,威胁环境安全和人类健康。同时,Sp34也能抑制其它有害水华藻类的生长,包括惠氏微囊藻和席藻。因而利用Sp34作为潜在控藻资源具有重要应用价值。Sp34通过释放胞外溶藻物质的间接方式溶藻,并且,溶藻物质可能为具有温度和酸碱耐受性的非蛋白类物质。通过对其溶藻物质性质的研究,为后续分离纯化溶藻物质提供支持和指导。3.菌株Sp34分泌的胞外溶藻物质的溶藻条件探究。24 h光照和14:10 h光暗循环的条件下,菌株Sp34无菌上清液的溶藻效果远远高于黑暗条件下,其溶藻作用具有一定的光依赖性。此外,28°C下,其无菌上清液的杀藻率显著高于15°C时。同时,28℃时,藻的生长受到促进,而15℃时,藻的生长受到抑制。结合温度和光照实验,Sp34无菌上清液的杀藻率与铜绿微囊藻的生长显著正相关,其产生的胞外溶藻物质的杀藻作用依赖于铜绿微囊藻的良好生长,因此,菌株Sp34或者其溶藻物质在严重蓝藻水华的控制方面很有应用前景。4.菌株Sp34分泌的胞外溶藻物质的溶藻机制研究。Sp34无菌上清液处理后,铜绿微囊藻细胞完整性受到严重破坏,细胞内过氧化氢酶(CAT)活性以及丙二醛(MDA)含量显著增加,还原型谷胱甘肽(GSH)含量显著减少。Sp34无菌上清液可能导致藻细胞的氧化胁迫,并进一步引起藻细胞膜的脂质过氧化。此外,本研究证实了菌株Sp34分泌的胞外溶藻物质严重抑制了铜绿微囊藻DCM4的光合作用相关基因psaB、psbD1和rbcL的转录表达,DNA修复相关基因recA和微囊藻毒素合成相关基因mcyB的转录表达。因此,对菌株Sp34分泌的胞外溶藻物质溶解铜绿微囊藻的作用机制的初步猜测为:在芽孢杆菌Sp34分泌的溶藻物质作用下,对藻细胞造成氧化胁迫,触发藻细胞内抗氧化机制,使得藻细胞内CAT含量升高而GSH含量降低;氧化胁迫的进一步作用下,藻细胞膜发生脂质过氧化反应,导致膜脂质过氧化产物MDA含量增加,进而导致藻细胞完整性的破坏。同时其分泌的胞外溶藻物质也对藻细胞的DNA造成损伤,影响藻细胞光合作用的正常运行,抑制藻细胞内微囊藻毒素的合成,最终杀灭藻细胞。5.溶藻物质色胺的鉴定及其溶藻特性研究。Bacillus licheniformis Sp34能在含有色氨酸的培养基中产生色胺。同时,Sp34的1/8 LB培养液中也含有色胺,色胺对铜绿微囊藻DCM4具有良好的溶藻作用,Sp34主要通过分泌胞外溶藻物质溶藻,因此推测色胺是Sp34分泌的溶藻物质之一。色胺的溶藻作用具有一定的光依赖性和温度依赖性,结合其温度和光照实验,其溶藻作用依赖于铜绿微囊藻的良好生长。6.色胺溶藻机制的初步研究。色胺的作用下,藻细胞内ROS含量快速增加,藻细胞内氧化水平显著升高,可能导致藻细胞的氧化损伤。细胞内部总蛋白和碳水化合物含量显著下降,单个藻细胞内蛋白和糖含量增加,表明色胺可能导致藻细胞分裂受到抑制,严重影响藻细胞的生长,最终造成藻细胞死亡。综上,本研究分析了一株来自滇池的高效溶藻菌及其分泌的溶藻物质对同样分离自滇池的铜绿微囊藻的溶藻特性及溶藻机制。本研究成果将为蓝藻水华的微生物治理提供控藻资源与相关理论指导。
【学位单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：X52;X172
【部分图文】：

研究技术路线

下生长良好。为了进一步对 Sp34 进行鉴定，其 16S rRNA 基因序列测得后，在EZBioCloud 和 NCBI 数据库进行 BLAST 比对，发现其与多株芽孢杆菌(Bacillus sp.)的相似度超过99%。根据菌株Sp34的16S rRNA基因序列构建系统发育树（图2-1），结果其与地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)亲缘关系最近。图 2-1 菌株 Sp34 的系统发育树Figure 2-1 Phylogenetic tree of Sp34 based on 16S rRNA gene sequences2.2.1.2 溶藻菌的生长曲线为了后续实验的方便与统一，测定了溶藻菌 Sp34 的生长曲线。结果如图 2-2所示，根据生长曲线，可以判断出Sp34在本实验的条件下的不同生长时期分别为：调整期（0-2 h），对数期（2-6 h），稳定期（6-8 h）。后续实验选择稳定期的菌进行（OD600值为 0.7）。

图 2-2 Sp34 的生长曲线。Figure 2-2 Growth curve of Sp34.速判断菌液的细胞数量，将 Sp34 菌液的 OD600值与细胞数量建-3 所示，OD600和细菌细胞数量具有良好的线性关系。后续实验数量时，可以通过 OD600值来获得。
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本文编号：2872408