火龙果色素相关bHLH转录因子克隆及功能分析

发布时间：2020-11-07 19:59

　　 火龙果作为一种典型的热带水果,近年来在种植上已成为农业新、特、优、高开发项目。尤其是红肉和紫红肉火龙果,它们色泽艳丽、营养丰富。这主要是由于其含有特殊的甜菜红素,甜菜红素价值很高,不仅可作为着色剂应用于工业生产中,还可开发成药品用于临床治疗。目前火龙果色素的生物合成代谢途径己基本清晰,代谢途径中的一些关键酶也得以分离和克隆,但色素的调控机制还不是很清楚。实验室前期成功构建了不同发育时期贵州培育的紫红肉品种(紫红龙)和白肉品种(晶红龙)果实全长转录本,并从中筛选出与色素相关差异表达的bHLH转录因子EST片段,进而丰富火龙果色素合成的分子调控机理,为培育出火龙果优质品种提供理论依据。基于转录组数据,从中筛选到了6个差异表达bHLH转录本序列。本文以不同发育时期火龙果为材料,利用qRT-PCR对可能与色素相关的bHLH转录因子进行了筛选,采用RT-PCR方法克隆了一个与色素可能相关的bHLH转录因子(HubHLH2)全长序列,成功构建其诱饵载体,建立了酵母双杂交文库并进行了酵母文库筛选。主要研究结果如下:1.利用qRT-PCR技术分析6个bHLH候选基因在火龙果不同发育时期的表达情况,结果显示:在不同的发育时期HubHLH11270、HubHLH3826、HubHLH49630、HubHLH54630这些转录因子并没有呈现出很明显变化趋势。HubHLH1637在红肉中表达量呈明显上升趋势,但在白肉中呈现先下降后上升的趋势。而HubHLH2在红肉中表达量恰恰相反它呈现逐渐下降的趋势,在白肉中的表达量从整体上看要比在红肉中高,且红白肉间存在差异。2.根据三代转录组数据,运用RT-PCR技术,从火龙果中克隆出了一个bHLH转录因子,命名为HubHLH2。该基因的ORF为1524 bp,编码508个氨基酸,其含有bHLH-MYC_N结构域以及典型的HLH保守结构域。其分子量为124.55KD,pI为5.03,且是疏水蛋白无跨膜区及信号肽。氨基酸序列比对结果显示HubHLH2与其他高等植物的bHLH蛋白具有较高的同源性,说明在HLH结构域上保守程度较高,其中HubHLH2蛋白与虎耳草(Amaranthus hypochondriacus XP_010679205.1)同源性最高,达到95.9%。其次是与奎藜(Chenopodium quinoaXP_021764267.1)、甜菜(Beta vulgaris XP_010679205.1)同源性较高,为94.5%。构建系统发育树结果显示HubHLH2与拟南芥JAMs蛋白及MYC类蛋白遗传距离较近,其中与JAM3遗传距离最近。3.HubHLH2的组织特异性分析显示:HubHLH2主要在根中表达,而茎和果实中相对表达量较低。该结果预示,HubHLH2可能主要在根中发挥重要的作用。用MeJA处理结果分析表明:MeJA会促进HubHLH2的表达,在1 h后的HubHLH2表达会升高,而在2 h后下降,但之后HubHLH2表达量又开始回升,在12 h达到最大值。4.以Invitrogen的Clone Miner 2 Library技术成功构建了三框型酵母cDNA文库,其中初级文库总克隆数达到1.44×10~7,重组率为96%,平均插入片段长度大于1 kb;次级文库总克隆数为9.6×10~6,重组率为100%,平均插入片段长度大于1 kb;将文库质粒转入Y187菌株经鉴定文库滴度大于3×10~7 cells/mL。5.构建pGBKT7-HubHLH2诱饵载体,将其转入酵母Y2HOLD菌株中进行自激活作用及毒性检测,结果表明诱饵蛋白(HubHLH2)无自激活且对酵母菌株也无毒害作用。6.采用Mating法筛选火龙果酵母文库,初步筛选得到24个可能与HubHLH2互作的蛋白质,通过Blast比对分析发现,筛选出的蛋白主要是与糖酵解和糖异生以及光合作用中卡尔文循环相关酶,如跨膜ATP酶、细胞色素b6f复合体、铁氧化还原酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶等。除此之外,还发现HubHLH2与SPL家族基因互作,故推测HubHLH2可能除参与DNA修复、转录及转录后调控、细胞信号转导、细胞凋亡等生命过程外,还可能由SPL基因介导调控色素合成。
【学位单位】：贵州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S667.9;Q943.2
【部分图文】：

1 bHLH 基序及其目标 DNA 复合体（Ma et al，1x formed between bHLH motif and its target DNA（因子的分类等（1997）人根据 bHLH 的 DNA 结合模式分为六个组分（A、B、C、D、E、F）。而 组，Buck 等（2003）从拟南芥的 147 个 b由于植物与动物中 bHLH 转录因子结构和生也是相对独立的，故植物和动物中关于 beim 等（2003）在拟南芥中发现了 133 个 b族；随后又出现了 14 个新的 bHLH 转录因步分成 21 个亚家族。而 Li 等（2006）则根

2.3 结果与分析2.3.1 火龙果总 RNA 质量及反转录检测采用 2.2.1.2 所述方法提取各个时期的火龙果果实的总 RNA，电泳检测 质量，结果（图 2-1，A）显示：RNA 条带无拖尾现象，18S 和 28S 条带清见，且 28S 条带亮度约为 18S 的两倍，这说明提取的 RNA 质量较好，未降无 DNA 和蛋白质的污染。用酶标仪检测 RNA 质量显示 OD260/OD280 均在左右，进一步说明提取的 RNA 可以满足后续实验要求。将总 RNA 反转成 c第一条链，并以反转录产物为模板进行扩增。获到与预期的大小一致 167 b右的产物（图 2-1，B），条带带型稳定，表明反转录成功，可以用于下一验。

贵州大学 2019 届硕士研究生学位论文2.3.2 不同发育时期 HubHLHs 的 qRT-PCR 检测本实验中 qRT-PCR 溶解曲线和扩增曲线如图 2-2 所示，结果显示目的基因引物和内参引物的溶解曲线均很平滑无波动呈单峰曲线，这说明引物的特异性很好。扩增曲线存在明显基线期、指数期和平台期，基线平直，各管的平行性好，表明各反应管的扩增效率十分接近。
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本文编号：2874405