磷脂酶D的重组表达及其在磷脂酰丝氨酸合成中的应用

发布时间：2020-11-09 03:15

　　 对磷脂酶D(phospholipase D,PLD)进行重组表达,并探究其在生物催化合成磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)中的应用。以大肠杆菌E. coli BL21 (DE3)作为PLD的异源表达宿主,构建重组菌E. coli BL21(DE3)/p ET-28a(+)-sspld,通过蛋白分析确定其分子量,并对培养条件进行优化,进一步探究重组菌的酶学性质。在有机相-水相双相反应体系中进行PS的制备,并对制备工艺进行系统优化。成功构建了重组菌株E. coli BL21 (DE3)/p ET-28a(+)-sspld,通过蛋白分析确定其分子质量约为60 k Da。重组菌通过诱导条件优化,酶活最高可达38. 58 U/m L,是优化前的2. 26倍。PLD粗酶液的最适p H值为7. 5,最适反应温度为60℃。制备工艺优化结果表明40℃条件下,在8 m L的乙酸乙酯中溶解64 mg的卵磷脂,在4 m L酶液中溶解160 mg的L-丝氨酸,得到的PS转化率最高,可达28%,产量为1. 34 g/L。该PLD粗酶液催化性能良好,为酶法制备磷脂酰丝氨酸奠定了基础。
【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 材料
        1.1.1 菌株和质粒
        1.1.2 主要仪器与试剂
        1.1.3 培养基
    1.2 方法
        1.2.1 构建重组质粒pET-28a （+） -sspld
        1.2.2 表达重组质粒pET-28a （+） -sspld
        1.2.3 酶活检测
        1.2.4 培养条件优化
        1.2.5 酶学性质
        1.2.6 产物PS的检测分析
        1.2.7 PS的制备工艺优化
2 结果与分析
    2.1 重组菌株的构建
    2.2 重组菌株诱导条件优化
    2.3 酶学性质研究
        2.3.1 最适反应p H和pH稳定性
        2.3.2 最适反应温度和温度稳定性
        2.3.3 金属离子及化学试剂对酶活的影响
    2.4 PS的制备工艺优化
3 结论

【参考文献】

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【二级参考文献】

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