哺乳动物O-甘露聚糖的化学酶法合成研究

发布时间：2020-11-09 00:22

　　 蛋白质的O-甘露糖基化修饰于1 979年首次发现存在于哺乳动物中,而在此之前这种糖基化修饰形式被认为仅存在于真菌中。随着近些年糖组学和糖蛋白组学的发展,科学家们发现O-甘露糖基化修饰广泛存在于哺乳动物的蛋白质修饰中。目前研究表明,哺乳动物脑组织中约30%的O-聚糖为O-甘露聚糖,已经确证的O-甘露糖基化修饰的蛋白聚糖有50余种。O-甘露聚糖结构是通过甘露糖以α构型糖苷键连接到蛋白质丝氨酸或苏氨酸残基上,在此基础上,N-乙酰氨基葡糖(GlcNAc)单元被引入到甘露糖的不同位点。根据GlcNAc引入位点的不同,O-甘露聚糖可分为Core M1、Core M2和Core M3 3个核心结构。在这3个核心结构的基础上,糖链可以被进一步延伸,以不同的糖苷键形式引入半乳糖、唾液酸、岩藻糖、葡萄糖醛酸以及及磺酸化和磷酸化修饰,从而生成结构极其复杂多样的O-甘露聚糖结构。O-甘露聚糖结构上的多样性赋予其丰富的生物学功能。尽管有50余种O-甘露蛋白聚糖被鉴定,但是目前的研究仅集中在O-甘露糖基化修饰的α-肌营养不良蛋白聚糖(α-dystroglycan,α-DG)上。α-DG是细胞膜表面的重要组成部分,其与抗肌萎缩蛋白(dystrophin)和肌聚糖(sarcoglycan)共同组成肌营养不良蛋白复合物(dystrophin-glycoprotein complex,DGC),介导胞内与胞外基质的相互作用。α-DG上O-甘露糖基化修饰异常会导致各种程度不同的先天性肌营养不良症(congenital muscular dystrophies,CMDs)。目前的研究还表明,O-甘露聚糖介导淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitis virus,LCMV)、萨拉热病毒(Lassa fever virus,LFV)等病毒对宿主细胞的入侵和感染,并且与肿瘤细胞的转移和扩散有关。此外,O-甘露聚糖对神经系统的发育、生长、修复以及信号传导方面都发挥重要作用。虽然Core M3 O-甘露聚糖的生物学功能已经明确,但是对于Core M1和Core M2 O-甘露聚糖的功能与生物合成途径还知之甚少。因此,结构确定的Core M1和Core M2 O-甘露聚糖分子高效获取具有重要的意义,其可以作为分子探针用来研究O-甘露聚糖的生物合成途径,以及用于在分子水平上阐释O-甘露聚糖多种生物学活性的作用机制,为糖链异常相关疾病的发生、发展和治疗提供理论依据。目前的O-甘露聚糖合成研究主要集中在结构简单的Core M1的合成上,大多数化学合成策略都是目标分子为导向的合成策略,需要经过很多步化学保护基操作,整体收率低,而且最终只能得到一个目标分子。已报道的酶法合成多受限于酶的来源,以及催化效率低、可溶性表达困难、底物适应性差等问题。在前期工作中,本实验室已经成功发展了一个多样化为导向的化学酶法合成策略用于Core M1 O-甘露聚糖的合成。该方法步骤简洁、收率高,实现了 6个Core M1 O-甘露聚糖的高效大量合成。在前期工作的基础上,本论文发展了一种以化学法合成的核心结构为基础的酶法模块化组装策略,首次成功合成了63个Core M1和Core M2 O-甘露聚糖结构,构建了结构复杂多样的O-甘露聚糖化合物库。该策略以克级化学合成的5个核心结构为基础,通过多样化为导向的3个酶法模块的串联使用,以最多4步反应步骤,成功获得了 58个复杂O-甘露聚糖结构。本论文主要包括以下几个方面:(1)化学合成5个O-甘露聚糖核心结构以氨基葡糖三氯乙酰亚胺酯和乳糖胺三氯乙酰亚胺酯为给体,利用C2位羟基裸露或者C2、C6位羟基裸露的丁二酮保护的甘露糖作为受体,经过一步平行糖苷化反应就可以高效获得5个全保护O-甘露聚糖核心结构,再经过简单、高效的脱保护操作,实现了 5个O-甘露聚糖核心结构的克级高效合成。(2)酶法模块化合成Core M1 O-甘露聚糖以化学合成的Core M1 C2分支二糖为起始底物,通过3个酶法模块的串联使用,分别引入半乳糖、唾液酸和岩藻糖,合成了 7个Core M1 O-甘露聚糖结构Ⅲ-16～Ⅲ-21。(3)酶法模块化合成C6分支Core M1 O-甘露聚糖以化学合成的C6分支二糖为起始底物,经过相同的3个酶法模块化串联使用,获得7个C6分支的Core M1 O-甘露聚糖Ⅲ-22～111-27。(4)酶法模块化合成对称性Core M2 O-甘露聚糖以化学合成的C2,6分支对称性Core M2三糖为起始底物,经过相同的3个酶法模块串联使用,同时在C2、C6分支引入相同的半乳糖、唾液酸以及岩藻糖,获得7个对称Core M2 O-甘露聚糖结构Ⅲ-28～111-33。(5)酶法模块化组装合成非对称性Core M2 O-甘露聚糖分别以化学合成的两个非对称四糖核心结构为起始原料,通过改变酶法模块化串联的顺序,以及利用糖基转移酶对不同结构底物专一性的差异,合成了全部可能存在的42个非对称性Core M2 O-甘露聚糖结构Ⅲ-34～111-73。本论文创新点包括以下几个方面:(1)通过巧妙的设计,仅使用两个通用的糖基给体和一个糖基受体,通过一釜法糖苷化和通用的脱保护基条件,实现了 5个O-甘露聚糖核心结构克级合成。(2)基于化学合成的5个核心结构,仅使用3个酶法组装模块,通过模块的串联使用和平行合成,以最长4步的线性步骤,在国际上首次实现了 O-甘露聚糖Core M1和Core M2全部63个结构的系统性、多样化合成。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q55
【部分图文】：

图１．１哺乳动物体内常见的１０种单糖单元??Ｆｉｇ．?１．１?Ｃｏｍｍｏｎ?ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ?ｆｏｕｎｄ?ｉｎ?ｍａｍｍａｌｉａｎｓ．??哺乳动物体内糖链主要含有１０种单糖单元（如图１．１）。其屮唾液酸有，乙??醜祌经氨酸（ｙＶ－ａｃｅｔｙｌｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ?ａｃｉｄ，?Ｎｅｕ５Ａｃ）?ＩＩＩ?轻乙酰祌经?Ｍ?酸??（ＶＶ－ｇｌｙｃｏｌｙｌｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ?ａｃｉｄ，?Ｎｅｕ５Ｇｃ）两种存在形式，而人体内只丫了?Ｎｅｕ５Ａｃ?型的??唾液酸。不同于核酸和蛋白质，糖链的合成是是非模板驱动的，每个单糖单元都??可以提供多个糖基化位点，形成的糖苷键有ｃｃ／ｐ构型之分，另外还会有硫酸化、??甲基化、乙酰化、磷酸化等糖基化后修饰过程，因此这些单糖单元可以形成数??量庞大的糖链结构（表１．１产］。??经过３０亿年的生物进化，每个生物体的细胞表面都包被一层糖被，这层糖??被涵盖重要的生物信息。例如红细胞表面的糖链结构决定了血型类型（Ａ，?Ｂ，?ＡＢ，??或０型）Ｍ。在器官移植过程

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本文编号：2875584