糖苷水解酶GH5主要亚家族活性架构功能探究

发布时间：2020-11-09 19:17

　　 木质纤维素是地球上储量最丰富的可再生资源,其主要成分包括纤维素和各类半纤维素,如甘露聚糖和木聚糖等。通过糖苷水解酶,如纤维素酶,甘露聚糖酶和木聚糖酶催化降解,这些多糖成分可以被水解成可溶性糖,经过生物炼制可以转化为生物燃料和多种化工制品,这为解决当前世界所面临的环境污染和能源短缺提供了一个有效途径。显然,获得适用于特定工业环境的不同种类的糖苷水解酶是降低工业生产成本,加快木质纤维素转化的关键。虽然糖苷水解酶设计工作已经有很多成功的先例,但对它们的活性架构和催化过程分子机制的认识尚不深入。本文基于结构生物信息学方法,对GH5主要亚家族的纤维素酶和甘露聚糖酶进行了序列、结构和分子动态等方面的分析,定位了活性架构中与底物特异性相关的关键氨基酸残基,并对TfCe15A活性中心残基进行了丙氨酸筛选及功能分析,初步阐明GH5家族酶分子不同亚位点关键残基在酶催化中发挥的不同功能,为进一步的酶分子设计奠定了基础。本文的主要内容如下:1.通过对糖苷水解酶GH5家族中6个主要亚家族酶分子的结构生物信息学分析,阐明了不同亚家族酶分子间的主要异同点。对GH5家族主要亚家族序列、结构和分子动态分析显示,不同亚家族酶分子的主要差异存在于构成活性架构的8个loop 区域。比较不同亚家族活性中心序列谱发现,GH5家族酶分子负亚位点残基保守度最高,-1亚位点有3个残基在整个GH5家族内是完全保守的,一2亚位点也有一个色氨酸在GH5家族内完全保守,这些残基可能与催化断键密切相关;还有部分残基在单个亚家族内保守或相对保守,这些残基可能与不同亚家族之间的功能演化相关。2.通过对GH5_2亚家族纤维素酶和GH5_8甘露聚糖酶的结构分析和生化测定,发现了活性架构-1和-2亚位点关键残基在两个亚位点不同的底物识别机制。由于纤维素和甘露聚糖底物-1亚位点糖环不同程度的扭曲,在该亚位点两类底物O3空间位置存在差异,而在-2亚位点,纤维素和甘露聚糖差异在于O2的空间位置。相应地,结构比对结果显示,在-1亚位点,两个亚家族保守的组氨酸和天冬酰胺通过与-1O3的相互作用起到底物识别作用,而在-2亚位点,GH5 2亚家族相对保守的谷氨酸通过与-2O2的相互作用起到底物识别作用。3.通过对TfCe15A所有活性中心氨基酸残基的丙氨酸筛选及生化测定,揭示了活性中心残基在酶催化过程中发挥的不同作用。对TfCel5A活性中心共22个关键氨基酸进行了丙氨酸突变及结合常数Ka和酶活测定,并分析了关键残基在酶催化中发挥的功能。Ka测定结果显示,负亚位点残基在底物结合中至关重要,其中-2亚位点保守的色氨酸和-2/-3亚位点相对保守的带电残基对通过与底物-2/-3亚位点形成密集的氢键网络在底物初始结合中发挥了重要作用。酶活测定显示,-2到+1亚位点残基在催化断键中至关重要,其中与-1O2相互作用的保守组氨酸和酪氨酸通过稳定亲核试剂并维持其带电状态来协助催化断键;与-1O3相互作用的保守组氨酸和天冬酰胺通过与底物间的相互作用协助-1亚位点糖环的扭曲,该过程需要loop3较大幅度的运动;此外,-2和+1亚位点两个保守色氨酸也参与底物形变过程;根据相关残基在GH5家族中的高保守度可知,它们在催化断键中发挥的重要作用在整个GH5家族中是一致的。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q55
【部分图文】：

乳糖醛酸Ｉ（ＲＧＩ），其主链是由半乳糖醛酸和鼠李糖通过ａ－１，２和ａ－１，４糖苷键交??替连接而成，这类果胶的侧链主要为Ｐ－Ｕ４－半乳聚糖、ｐ－１．６－半乳聚糖和（Ｘ－１．５－??阿拉伯聚糖（图１－１?Ｅ）。??由于果胶结构的复杂性，其合成需要超过６５种不同酶活性，其中包括半乳??糖醛酸转移酶等主链合成酶以及甲基转移酶、｜３－１，４－半乳糖基转移酶和ａ－１，３－木??糖基转移酶等侧链合成酶［２５－２７］。??％?＜?ＨＩｂＵｍ?■Ｍｒａｆｌｂｒｌｌ?ＨｒＭｔｃＨｔａｔｎＭ??ｎ．?＿龃．．????。；：??图１－１植物细胞壁的主要多糖成分｜６，?１９｜??（Ａ）细胞壁中主要多糖相互作用的简化模型。（Ｂ）纤维素基元纤丝的３６链模型。这??里葡聚糖链的描述是基于Ｘ光衍射测定的纤维素１卩结构。纤维素基元纤丝可能含有三??组葡聚糖链：Ｃ１组（红色）是六个真正的结晶链；Ｃ２组（绿色）中有１２个具有微小??杂乱度的亚结晶链；Ｃ３组（蓝色）中有１８个具有很大杂乱度的亚结晶表面链。（Ｃ）??纤维素Ｉｐ结构中的链内和链间氢键网络。（Ｄ）半纤维素结构简图。（Ｅ）果胶结构简图??Ｆｉｇｕｒｅ?１－１?Ｍａｉｎ?ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ?ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ?ｏｆ?ｐｌａｎｔ?ｃｅｌｌ?ｗａｌｌｓ??（Ａ）?Ａ?ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ?ｍｏｄｅｌ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｍａｊｏｒ?ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ?ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ?ｉｎ?ｔｈｅ?ｃｅｌｌ?ｗａｌｌ．?（Ｂ）?Ａ?３６－??ｃｈａｉｎ?ｍｏｄｅｌ?ｏｆ?ｃｅｌｌｕ

ＣＨＧ）、木糖聚半乳糖醛酸（ＸＧ）和鼠李聚半乳糖醛酸ＩＩ?（ＲＧＩ１）主链降解主要??需要来自ＧＨ２８家族的内切聚半乳糖醛酸酶（ＥＣ３．２．Ｉ．１５）和外切聚半乳糖醛酸??酶（ＥＣ３．２．１．６７），而，鼠李聚半乳糖醛酸Ｉ?（ＲＧＩ）主链降解主要需要同样来自??ＧＨ２８家族的内切鼠李聚半乳糖醛酸酶（ＥＣ?３．２．１．１７１）、外切鼠李聚半乳糖醛酸??酶（ＥＣ?３．２．１．１７３）和ａ－鼠李糖苷酶（ＥＣ?３．２．１．４０）。此外，来自ＰＬ１家族的果胶??裂解酶和来Ｇ?ＰＬＩ、ＰＬ３和ＰＬ９采胶酸裂解酶等在果胶主链降解中也发挥了重要??作用（图?１－２）?［６１－６３］。??除了主链降解酶外，果胶的降解还需要大量的侧链降解酶，如来自ＧＨ５１和??ＧＨ５４家族的ａ－阿拉伯呋喃糖苷酶、来自ＧＨ４３家族的内切阿拉伯聚糖酶、来自??ＧＨ９３家族的外切阿拉伯聚糖酶、来自ＧＨ２和ＧＨ３５家族的（３－半乳糖苷酶、来??自ＧＨ５３家族的ｐ－内切半乳聚糖酶以及来Ａ?ＧＨ３和ＧＨ４３家族的Ｐ－木糖苷酶??等。此外，来自ＣＥ８家族的果胶甲基酯酶、来自ＣＥ１２和ＣＥ１６家族的果胶乙酰??基酯酶和来自ＣＥ１的阿魏酸酯酶也在果胶侧链降解中发挥ｆ重要作用。??

空间结构中连续成簇存在并在进化中存在较强的关联性，被称为蛋白质功能区??（Ｓｅｃｔｏｒ）?［６４］。在酶分子中，最重要的功能区是“活性架构（Ａｃｔｉｖｅ－ｓｉｔｅ?ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ）’’，??其由与底物相互作用的氨基酸残基构成（图１－３），占整个酶的２％－３°／。，在酶底??物识别、催化和产物释放中发挥重要作用［６，?６５］。??在糖苷水解酶中，活性架构残基参与糖类底物的识别和结合、糖苷键的断裂??以及寡糖和单糖产物的释放，因此与酶的底物特异性和酶活力直接相关。由于活??性架构残基在进化中的关联性，同家族酶的活性架构残基具有一定的保守性，这??些保守和相对保守的残基在酶功能的执行中发挥了重要作用［６６－６８］。??ＴｉＣｅ＼５＼?ＴｉＣｄｌＢ?ＴｉＣｅＷｌＡ??聲：書．??图１－３来自不同家族里氏木霉纤维素酶的活性架构??从左到右分别来自ＧＨ５?（ＰＤＢ３ＱＲ３，底物来自结构２ＣＫＲ）、ＧＨ７?（ＰＤＢ１ＥＧ１，底??物来自结构４Ｃ４Ｃ）和ＧＨ１２家族（ＰＤＢ１Ｈ８Ｖ，底物来自结构１Ｗ２Ｕ）。酶分子以灰??色卡通和表面模式显示，活性架构显示为蓝色，底物显示为绿色。??Ｆｉｇｕｒｅ?１－３?Ａｃｔｉｖｅ?ｓｉｔｅ?ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ?ｏｆ?Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ?ｒｅｅｓｅｉ?ｃｅｌｌｕｌａｓｅ?ｆｒｏｍ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ＧＨ??ｆａｍｉｌｉｅｓ??Ｔｈｅ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｆｒｏｍ?ｌｅｆｔ?ｔｏ?ｒｉｇｈｔ?ａｒｅ?ｆｒｏｍ?ＧＨ５?（ＰＤＢ?３ＱＲ３．?ｓｕｂｓｔｒａｔｅ?ｆｒｏｍ?２ＣＫＲ）
【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 梁伟辉;陈少华;查显丰;吴奇峰;徐琳;李萡;李扬秋;;汞对作业工人周围血T细胞受体-Vβ亚家族表达影响[J];中国职业医学;2012年03期

2 赵友恒;;免疫性血小板减少征患者外周血T细胞受体β链V区亚家族的表达及临床意义[J];临床医学;2015年07期

3 曾星,蔡萃,欧爱华,黄羽,张娴;严重急性呼吸综合征患者康复期T细胞受体Vβ24个亚家族取用格局分析[J];中华结核和呼吸杂志;2005年01期

4 张成岗,邢桂春,魏汉东,鱼咏涛,贺福初;人X染色体含有一个黑色素瘤抗原基因亚家族[J];遗传学报;2001年03期

5 曾星;蔡萃;黄羽;欧爱华;张娴;;SARS患者康复期淋巴细胞功能状态及T细胞受体Vβ24个亚家族表达的格局(英文)[J];中国组织工程研究与临床康复;2007年43期

6 涂春根,商俊伟;全球最大的钽原料供应商——瓜利亚家族有限公司(Sons of Gwalia Ltd)[J];稀有金属与硬质合金;2003年03期

7 杜欣,李扬秋,林伟,苏建华,黄梓伦,李树浓;慢性移植物抗宿主病患者T细胞受体Vβ亚家族T细胞的免疫重建[J];癌症;2001年01期

8 郑继军;王阁;;整合素β1亚家族与肝癌粘附转移的相关研究进展[J];中国肿瘤临床;2005年24期

9 樊静;丝氨酸蛋白酶抑制剂B亚家族[J];生命的化学;2003年04期

10 黄薇;吴坤陆;;丝氨酸蛋白酶抑制剂亚家族在免疫调节中的作用[J];生命的化学;2010年03期

相关博士学位论文 前10条

1 王海坤;Tyro 3亚家族受体酪氨酸激酶在调节造血中的功能[D];中国协和医科大学;2007年

2 唐晓婧;CYP2C亚家族组织特异性表达模式中的表观遗传学调控机制[D];浙江大学;2017年

3 温博;基于流式细胞术的类风湿关节炎实验研究[D];成都中医药大学;2014年

4 宣丽;G-CSF动员后外周血T细胞受体谱系以及γδT细胞功能亚群变化的研究[D];南方医科大学;2014年

5 司大勇;CYP2C亚家族药物代谢酶基因多态性及功能研究[D];吉林大学;2008年

6 俞志明;EXPA7亚家族调控水稻根毛伸长机制研究[D];浙江大学;2010年

7 魏春华;茄科物种全基因组抗病基因鉴定及其进化分析[D];华中农业大学;2015年

8 曹立环;细胞周期调节关键分子Rb和CDK的分子进化分析[D];复旦大学;2013年

9 郭齐雅;岩藻糖转移酶Ⅵ在肝癌中的功能研究暨α1,3/4岩藻糖转移酶亚家族的生物信息学分析[D];复旦大学;2011年

10 范凯;植物转录因子NAP的系统发育及其对叶片衰老的调控[D];浙江大学;2015年

相关硕士学位论文 前10条

1 田震楠;糖苷水解酶GH5主要亚家族活性架构功能探究[D];山东大学;2019年

2 王静;O-糖基转移酶新亚家族的功能性质研究及酶底物筛选法的建立[D];上海交通大学;2011年

3 郭宁宁;肺癌患者TCR Vβ亚家族表达及T细胞功能的研究[D];广东药学院;2011年

4 李光;ABCA亚家族在脊索动物中的进化[D];厦门大学;2006年

5 冯冠乔;葡萄R2R3-MYB基因家族7个亚家族的分子进化与表达分析[D];南京农业大学;2013年

6 周燕茹;灰飞虱体内AGO家族的鉴定及其表达分析[D];浙江师范大学;2015年

7 杨冬;TCR Vβ亚家族克隆性T细胞在异基因造血干细胞移植后表达的实验研究[D];第一军医大学;2001年

8 郭钦丽;vMIP-Ⅱ对SIV感染的食蟹猴TCRVβ基因表达和T细胞增殖影响的探讨[D];暨南大学;2005年

9 张国云;RhoA亚家族分子对胃癌细胞增殖与侵袭的影响[D];第四军医大学;2006年

10 赵辉;SLE患者TCRβv亚家族表达与临床表现相关性研究[D];成都中医药大学;2009年

本文编号：2876858