东方蝾螈IL-8在肢体再生过程中的表达变化

发布时间：2020-11-09 20:52

　　研究背景:外伤后的肢体再生一直是医学的难点和研究热点,免疫系统及其调控机制被认为在伤口愈合及再生完成的过程中发挥着关键的作用。有尾两栖类动物蝾螈,具有独特而强大的再生能力,是研究肢体再生过程中的理想模型。巨噬细胞对肢体早期再生过程至关重要,但是对启动巨噬细胞募集至损伤部位的信号,目前还不清楚。白介素8(IL-8)是一种对巨噬细胞有强烈趋化作用的细胞因子,在炎症反应中起到关键作用,IL-8也参与细胞的迁移、血管生成、有丝分裂等生命活动。但是IL-8在伤口愈合和再生中的作用及其机制的相关研究却很少。方法及结果:本实验首先建立东方蝾螈断肢再生模型,根据蝾螈转录组测序结果设计合成引物,利用PCR技术首次克隆出蝾螈IL-8基因开放阅读框(ORF)共306bp,可编码101个氨基酸。通过构建原核表达载体pET32a/IL-8,成功诱导表达IL-8融合蛋白,其大小约为29kD。随后将镍柱纯化得到的融合蛋白作为抗原,制备蝾螈IL-8多克隆抗体,并利用ELISA、细胞转染、Western Blot等技术检测抗体特异性。利用实时荧光定量PCR(QRT-PCR),切片原位杂交技术观察蝾螈肢体再生不同时间点IL-8在核酸水平的表达变化和分布,发现IL-8 mRNA在肢体再生早期有明显的上调,随着伤口愈合IL-8表达量逐渐下调,直到肢体再生14dpa(day post amputation)恢复到正常水平,IL-8 mRNA表达主要集中分布在肢体截肢部位处。随后利用IL-8多克隆抗体,观察肢体再生不同时间点IL-8在蛋白水平的表达变化及分布,通过Western Blot结果显示在蝾螈断肢后,IL-8蛋白表达量持续升高,在再生3dpa时达到峰值,直至再生14dpa左右IL-8蛋白的表达逐渐恢复到正常基线水平,利用荧光免疫组织染色技术在肢体再生早期伤口处检测到大量IL-8阳性细胞。结论:本研究证实IL-8表达在蝾螈肢体再生的早期显著上调,推测IL-8可能参与肢体再生早期过程。这为进一步揭示IL-8基因在肢体再生过程中的功能,解释其相关作用机制提供了基础。
【学位单位】：西北大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q75;Q78
【部分图文】：

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菌；（4） 100mg/mL 氨苄青霉素：以 1:10 的比例溶解到 ddH2O 中，之后用 0.22μm 无菌滤膜过滤，分装到 1.5mL 的无菌离心管中备用。2.6 试验方法2.6.1 断肢模型建立将体长在 6-8mm 的健康蝾螈置于 0.1％三卡因溶液中 7-10 分钟麻醉蝾螈，使用灭菌剪刀于蝾螈体侧右上方肢体的肘关节上方 1mm 处截断（见图 1），用镊子向后推动附着在骨骼上的肌肉组织，用 12 厘米弹簧剪修剪突出的肌肉组织，并确保表面截肢的是扁平的（任何突出的骨头都会妨碍伤口愈合过程并延迟再生，这也可能导致肢体再生过程中伤口上皮破裂和真菌感染）。将蝾螈转移至清水中，在 25℃下饲养，每 24 小时后更换清水。随后分别在再生 0dpa、3dpa、7dpa、14dpa、30dpa、42dpa 对断肢进行样本采集，每个时间点至少取 5 个样本。

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.2 PCR 获取目的基因 IL-8本实验通过 IL-8 基因引物设计，利用提取的再生过程中不同时间点逆转录得到蝾螈肢体的 cDNA，利用 PCR 进行蝾螈 IL-8 基因序列扩增糖凝胶电泳检测（见图 2），发现其在目的片段大小处有一段很清晰单 306bp，电泳结果如下图所示。时间（dpa） OD260/OD280 浓度（μg/μL0 1.840 0.4403 1.880 0.5207 1.956 0.29914 1.953 0.32730 1.946 0.11442 1.890 0.138

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