绵羊脐带间充质干细胞iPSCs诱导及定向分化的研究

发布时间：2020-11-10 10:44

　　 脐带间充质干细胞(Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells,UCMSCs)是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞。UCMSCs具有来源丰富、不涉及伦理道德、低免疫原性、体外扩增能力强及能分化为多种体细胞等特征,因此,UCMSCs的相关研究备受关注。目前,已成功从人、大鼠、兔、猪等动物分离获得脐带间充质干细胞,但与其相比,关于绵羊脐带间充质干细胞(sheep Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells,sUCMSCs)的分离、培养及定向分化等研究的相关报道甚少。绵羊是基础生物学及畜牧学等研究领域的重要大动物模型。据此,本研究在改良sUCMSCs分离及培养体系的基础上,探讨了诱导sUCMSCs为诱导多能性干细胞(Induced Pluripotent Stem Cells,iPSCs)的同时将sUCMSCs定向诱导分化为成肌细胞并初步探究其在体内修复损伤组织的作用机制。本研究主要研究结果如下:1.建立了组织块二次贴壁分离绵羊脐带间充质干细胞的方法,并用改良的无血清体系在体外扩增培养获得了绵羊脐带间充质干细胞,经鉴定,所获得的sUCMSCs的免疫表型在高表达CD90、CD105及CD44(表达量在95%以上)的同时,低表达CD45、CD34及CD14(表达量在2%以下)。此外,组织块二次贴壁法获得的sUCMSCs可在体外传至12代,并且能向成骨、成脂及成软骨细胞方向分化。2.采用Yamanaka的OSKM四因子方法诱导sUCMSCs为iPSCs,获得了类胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells,ESCs)的克隆样细胞,对其进行碱性磷酸酶染色鉴定,结果显示克隆呈棕红色的阳性结果;此外,对所获得的克隆进行多能性因子表达情况的检测,结果发现,克隆表达多能性因子OCT-4、SSEA-4、Nanog及TRA-1-81;为检测获得的sUCMSCs来源的克隆在体内分化能力,将克隆制备成单细胞悬液后注射免疫缺陷小鼠腋下,在注射后第4周采集畸胎瘤制成石蜡切片后进行HE染色,在倒置显微镜下可观察到肌肉、毛囊、腺体等三个胚层的组织。3.采用5-氮杂胞苷联合马血清法,诱导sUCMSCs分化为成肌细胞,检测分化不同时期成肌细胞标志蛋白Desmin、MyHC及MyoD与标志分子Desmin、Myf5及MyoG的表达情况;此外,将sUCMSCs、分化第14天的成肌细胞及丝裂霉素C处理的sUCMSCs移植入肌肉损伤模型小鼠的胫骨前肌,在移植细胞后不同时间经石蜡切片并HE染色,检测小鼠损伤的肌肉的修复情况。结果显示:(1)在5-氮杂胞苷及马血清的联合作用下,sUCMSCs在诱导分化第3天Myf5基因开始表达;第7天个别细胞形态发生改变,呈杆状、多角状,细胞增殖减缓,且成肌细胞标志蛋白Desmin、MyHC及MyoD均有表达,有部分细胞发生融合;在分化第14天Desmin及MyoG基因表达量升高,细胞增殖持续减缓,融合细胞增多,且融合后的细胞内细胞核增多;在分化的第21天Desmin基因表达量骤升,且细胞代谢产物增多,出现肌管样结构;(2)在细胞移植后,sUCMSCs组小鼠损伤肌肉后第2天即进入修复期,在第10天肌纤维排列致密,彼此融合,损伤肌肉基本恢复正常;成肌细胞组小鼠损伤肌肉第3天即进入修复期,在第14天肌纤维排列致密,彼此融合,损伤肌肉基本恢复正常;丝裂霉素C组及对照组小鼠损伤肌肉在第2-3天进入修复期,且在第10天损伤肌肉未能完全修复,肌纤维之间仍存在明显的空隙,第14天肌肉也未能完全恢复正常。综上所述,采用二次贴壁法及无血清培养体系可获得形态及体外增殖能力正常、且表达间充质干细胞表面标志分子并具有多向分化潜能的sUCMSCs。所获得的sUCMSCs不仅能诱导为iPSCs,而且可分化为对小鼠损伤肌肉有修复功能的成肌细胞。本研究为建立完善的绵羊诱导多能干细胞技术及探明间充质干细胞的定向分化及修复机制提供科学依据。
【学位单位】：东北林业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q2-33
【部分图文】：

?传统组织块贴壁法，使用基础培养基（含ＦＢＳ）培养４８ｈ即贴壁４天可见呈长梭形的??细胞爬出（图２．１ａ），９天左右细胞融合度可达９０％?（图２．１ｂ）；使用无血清培养基培养的组??织块同样４８ｈ贴壁４天可见呈长梭形的细胞爬出（图２．１ｃ），１０天左右细胞融合度可达９０％??（图?２．１ｄ）。??二次贴壁法，使用基础培养基（含ＦＢＳ）培养２４ｈ即可见组织块贴壁，２天细胞即爬出??（图２．１ｅ），６天左右细胞融合度可达９０％?（图２．１ｆ）；使用无血清培养基２４ｈ可见组织块贴??壁，２天可见细胞爬出（图２．?ｌｇ），?６天左右细胞融合度可达９０％?（图２．?ｌｈ）。??４组细胞在贴壁伸展后均呈长梭形，待细胞融合度达８５％时，排列紧密，呈涡旋状或指??纹状，上述结果表明与传统组织块贴壁法相比，二次贴壁法的组织块贴壁更快，细胞爬出时??间更短，且能将有限的材料在短时间内充分利用并获取数量加倍的细胞。此外，通过比较含??血清的基础培养基与无血清培养基分离原代细胞的结果发现

养基培养的细胞使用Ｔｉｙｐｓｉｎ，而无血清培养基培养的细胞使用ＴｒｙｐＬＥ）将４组绵羊脐带间??充质干细胞进行消化传代扩增。??４组绵羊脐带间充质干细胞的Ｐ３代细胞增殖速度一致，３ｄ融合度均可达８５％?（图２．２??ａ，ｃ，ｅ，ｇ），且细胞排列紧密，呈指纹状，细胞形态均一，细胞呈成纤维细胞样贴壁生??长，细胞饱满，细胞核大，胞衆透明无杂质，而Ｐ１２代细胞在３＞４ｄ内融合度也可达８５％，??细胞形态正常，与Ｐ３代细胞相似，呈长梭形旋祸状贴壁生长（图２．２?ｂ，ｄ，ｆ，ｈ）。上述结??果表明，二次贴壁法获得的细胞与传统的贴壁法获得的细胞在传代培养后细胞生长速度一??致，细胞形态及状态无明显差异，无血清培养基并未因缺乏ＦＢＳ而对细胞造成不良影响，??传代后的细胞形态及生长状态与含ＦＢＳ培养基培养的细胞无明显差异

?台期，分别比较４组细胞Ｐ３及Ｐ１２代细胞的增殖能力发现，（１）传统贴壁法，间充质干细??胞基础培养基与无血清培养基获得的Ｐ３代细胞的増殖能力均强于Ｐ１２代细胞（图２．３?ｂ，??ｄ）；?（２）二次贴壁法，间充质干细胞基础培养基与无血清培养基获得的获得Ｐ３代细胞的增??殖能力均较Ｐ１２代细胞强（图２．３?ｃ，?ｅ）。上述结果说明，组织块二次贴壁法获得的绵羊脐??带间充质干细胞的增殖能力与传统组织块贴壁法获得的细胞无显著差异，此外，无血清培养??体系培养的细胞的增殖能力与含ＦＢＳ的培养基获得的细胞也无明显差异，但是Ｐ１２代细胞??的增殖能力比Ｐ３代细胞略低。??ａ?ｂｅ??２．〇ｉ??？１５＿?＾?ｊ??匕?１．０－??????
【参考文献】

相关期刊论文 前2条

1 邵伟;秦小惠;古再丽;况玲;余雄;;绵羊脐带间充质干细胞的分离、体外培养及诱导分化[J];新疆农业大学学报;2012年04期

2 张勇;邹仲敏;郭朝华;周进明;王劲;罗成基;程天民;;间充质干细胞经MyoD转染诱导为成肌细胞后对肌损伤的修复作用[J];解放军医学杂志;2008年11期

相关硕士学位论文 前1条

1 宋红卫;利用绵羊多能性因子诱导小鼠体细胞为多能性干细胞[D];东北林业大学;2016年

本文编号：2877840