枯草芽孢杆菌酱（豉）香风味基因的筛选及功能研究

发布时间：2020-11-10 19:02

　　 枯草芽孢杆菌高温发酵的酱香型食品(如白酒)、中低温发酵的豉香型食品(如豆豉)都受到人们的青睐,但酱香和豉香的产生机制至今还不清楚。研究通过对豆豉工业生产菌株Bacilus subtilis BJ3-2进行中温(45℃)和中低温(37℃)的转录组测序差异性和富集分析,筛选得到19个差异显著基因,分析选取5个显著差异基因作为风味候选基因并进行荧光验证,最终选取rocF(精氨酸酶)进行同源重组,双交换敲除以验证其在酱(豉)香上的生理功能,主要研究内容及结果如下:1.对Bacilus subtilis BJ3-2中温(45℃)、中低温(37℃)进行第二代转录组测序。通过表达量分析、差异基因的GO、KEGG注释和富集分析,将差异显著的58个基因富集在27个代谢通路,其中嘧啶代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、丙氨酸,天冬氨酸和谷氨酸代谢最为显著。控制筛选条件Fold-change≧2与FDR≦0.05,最终筛选出19个显著差异基因,结合文献报道和综合分析,选择rocF(精氨酸酶)、rocG(谷氨酸脱氢酶)、uxaC(葡萄糖醛酸异构酶)、uxuA(甘露酸脱氢酶)、pckA(磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶)为酱(豉)香候选基因。2.对转录组筛选出来的5个酱(豉)香候选基因进行荧光定量PCR验证。选用16S rRNA为内参基因,分别确定了5个酱(豉)香候选的基因的溶解曲线和扩增曲线,并计算出各自的基因表达差异,结合转录组差异发现,除uxaC外,rocF、rocG、uxuA、pckA的表达趋势和转录组测序的结果一致。3.构建rocF的同源重组双交换敲除载体:pUC18+HLarm+CmR+HRarm。以pUC18为初始载体,依次通过Sac I、BamH I、Pst I、Hind III限制性酶切位点将从BJ3-2基因组扩增的左臂(HLarm)、右臂(HRarm)以及pHT01cas9-p43载体上的氯霉素基因(CmR)连接,并通过菌落PCR、质粒PCR、双酶切、测序验证,最终获得pUC18+HLarm+CmR+HRarm重组交换载体。4.将双交换质粒载体转化BJ3-2中,转化效率达5×10~2cfu/μg,并通过革兰氏染色、RCR验证、测序验证,最终成功筛选出BJ3-2△rocF基因敲除菌株。5.利用BJ3-2△rocF和BJ3-2发酵豆豉,感官评定和氨气检测显示:BJ3-2△rocF发酵的豆豉较BJ3-2发酵的豆豉,37℃时,颜色、豉香、酱香、质地、氨味均无明显变化,仅黏丝略有降低;45℃时,颜色褐化程度降低,黏性增强,酱香味更加突出,氨味降低112.9 ppm。由实验结果得出:BJ3-2△rocF和BJ3-2 37℃发酵的豆豉感官变化不大,说明37℃时rocF与酱豉香风味无显著关系;传统认为褐化与酱香呈正相关,但45℃时,BJ3-2△rocF发酵的豆豉褐化程度减弱,说明褐化与酱香风味没有相关性,酱香味增强说明rocF是酱香风味重要的负调控基因,氨味降低,说明rocF通过精氨酸代谢影响氨气含量。研究通过成功敲除rocF,为研究酱(豉)香风味基因的功能提供了方法借鉴;通过转录组测序、荧光定量PCR验证、基因敲除等手段为探索酱香和豉香型产品中风味的形成机制提供了一定的理论基础。
【学位单位】：贵州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：TS201.3
【部分图文】：

图 1.1 Bacilus subtilis 中 TTMP 的产生途径Figure 1.1 Pathway of TTMP production in bacillus subtilis香风味基因的筛选方法方法有很多，主要有 mRNA 差异显示技术（杨晓霞 等，宏 等，2017）、转录组测序（汪最 等，2018）、抑制消减、基因敲除（张慧 等，2014）、基因突变（赵银娟 等，2 等，2016）、生物信息学、实时荧光定量 PCR 等，一般，但为保证筛选可信度，要根据研究对象、研究目的以及实研究。技术酸行使功能的主要承担者，是细胞功能和状态最直接的描述生物功能的必然纽带，转录水平调控是目前研究最多，也是

图 1.2 同源重组交换示意图Figure 1.2 Schematic diagram of homologous recombination exchange基因敲除或整合的主要步骤包括:(1)构建重组载体。(2)电击、化学诱导等方法将重组质粒转入宿主细胞。(3)筛选目的细胞或菌落。(4)传代培养并筛选已敲除或已整合的宿主。(5)进行形态观察及分子生物学检测。1.3.2 同源重组在枯草芽孢杆菌中的运用同源重组被发现后，科学家们很快就将该技术运用到生物学的各个领域。同源重组技术也被运用到了 Bacilus subtilis 上，Bacilus subtilis 由于高蛋白分泌能力和良好发酵基础被广泛地运用在工业生产中，为了提高菌株的优良特性，就需要对菌株进行分子改造张明俐（张明俐 等，2016）等利用同源重组技术，快速构建枯草芽孢杆菌 168（Bacilusubtilis168）spo0A 敲除载体 pMAD-Δspo0A，无痕敲除后得到了不长芽孢的枯草芽孢杆菌，对提高枯草芽孢杆菌工业生产效率有重要意义；张懿翔（张懿翔 等，2015）等通过同源重组将透明颤菌血红蛋白(VHb)基因(vgb)整合到枯草芽孢中，改善枯草芽孢杆菌

贵州大学硕士毕业论文4. 通过限制性内切酶（Sac I 和 BamH I）将 Bacilus subtilis BJ3-2 基因组中扩增的上游同源臂（HLarm ）通过连接 转化到大肠杆菌 DH5α 中， 提取得到质粒pUC18+HLarm+p43+cat+HRarm。5. pUC18 为克隆载体，只添加 p43 启动子和氯霉素的编码区，没有终止子并不能使菌株带有氯霉素抗性，因此对先前构建的 pUC18+HLarm+p43+cat+HRarm 载体进行完善，利用 Pst I、BamH I 酶切位点将质粒上的 p43+cat 替换成从 pHT01cas9-p43 质粒 上 带 有 启 动 子 、 编 码 区 、 终 止 子 的 CmR 基 因 。 利 用 在 线 网 址（http://molbiol-tools.ca/Promoters.htm）中的 BPROM 和 FindTerm 对 pHT01cas9-p43质粒上的 CmR 基因进行原核启动子和终止子分析预测，确定无误后进行后续实验。构建示意图，如图 2.1 所示（利用软件 SnapGene 制作）。
【参考文献】

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本文编号：2878241