拟南芥lncRNA介导种子成熟调控机制的初步研究

发布时间：2020-11-12 07:01

　　 种子成熟是一个特异、复杂的发育过程,不仅是决定种子质量和产量的关键时期,也是影响种子贮藏质量的重要环节。然而目前人们对种子成熟调控机制的认识还相对薄弱。LncRNA是一类长度大于200nt、无编码蛋白能力的RNA,近些年的研究表明它们在真核生物中种类丰富且分布广泛,能够在表观遗传、转录及转录后水平调控基因的表达或直接影响蛋白功能。目前人们对植物lncRNAs的功能及作用机理有了一定的认识,它们在许多生物过程中均发挥着重要的作用,然而尚未见到lncRNA在种子成熟中的功能及其作用机制方面的报道。本研究利用实验室建立的种子成熟调控因子鉴定体系,从种子贮藏蛋白的角度鉴定了介导种子成熟调控的lncRNAs并对其作用机理进行了初步探索,主要研究结果如下:1.收集拟南芥4个发育时期(4、7、12、17 DAP)的种子,经高通量检测及生物信息学分析共得到64个响应种子成熟的lncRNAs候选基因,其中24个为上调基因,40个为下调基因;24个lncRNAs位于基因转录模块区域,35个为基因间lncRNAs,5个为反义lncRNAs。2.挑选了9个lncRNAs进行了基因克隆并构建到表达载体中,利用蘸花侵染将6个上调表达的lncRNAs转化入gus23(种子成熟报告基因体系),3个下调表达的lncRNAs转化入野生型拟南芥,获得转基因纯合体后用于随后研究。3.通过GUS染色方法对6个转入gus23的基因是否参与种子成熟调控进行了初步分析,结果表明lncRNA-Seed9和lncRNA-Seed53可以导致gus23幼苗真叶出现GUS表型,暗示种子贮藏蛋白基因SSPs在这2个lncRNA过表达幼苗中异位表达。随后qPCR结果表明种子成熟调控因子LEC2与贮藏蛋白2S2基因在lncRNA-Seed53过表达幼苗中的表达量显著高于野生型。进一步对种子成熟主要调控因子在lncRNA-Seed53过表达植株种子中的表达情况进行了检测,结果表明在lncRNA-Seed53过表达植株7 DAP的果荚中LEC2基因有着较小幅度的上调表达;而在12 DAP的果荚中LEC1基因的表达量显著提高。这些结果表明lncRNA-Seed53是一个种子成熟的调控因子。4.对转基因植株种子及其它方面的表型进行了分析,结果表明lncRNA-Seed53过表达植株果荚短且饱满、果荚生长缓慢、种子大等表型,此外在幼苗期具有叶柄短、莲座叶圆且较小、早花、花苞紧凑且花瓣变短等表型。同时,我们也观察到lncRNA-Seed26过表达的种子萌芽受到抑制,并且植株具有萌芽晚,幼苗植株小的表型。5.为阐释lncRNA-Seed26和lncRNA-Seed53的调控机制进行了准备和初步探索。1)利用qPCR对2个lncRNAs的相邻基因表达情况进行了分析,结果表明lncRNA-Seed53可以抑制KIP1基因的表达;在lncRNA-Seed26过表达幼苗中TPPI基因的表达量提高,LRR基因的表达降低。2)为了深入研究这些lncRNAs的功能,我们针对lncRNA-Seed26和lncRNA-Seed53分别设计了两个gRNA靶点,构建了双gRNA靶点saCas9/gRNA载体,并进行了拟南芥转化。经筛选鉴定得到7株lncRNA-Seed26-CRISPR突变体植株,saCas9/gRNA载体编辑效率为2.083%;及3株lncRNA-Seed53-CRISPR突变体植株,saCas9/gRNA载体编辑效率为0.704%。3)我们通过生物信息学分析及重叠延伸PCR构建了35S:S1streptavidin-tagged lncRNA-Seed26载体,并筛选鉴定出T_1代S1-lncRNA-Seed26转基因植株,这为了鉴定该lncRNA的靶标基因奠定了基础。这些研究结果拓展了人们对种子成熟调控网络的认识及对植物lncRNA生物学功能的理解,为深入展开这些lncRNAs的调控机制研究奠定了基础。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q943.2
【部分图文】：

图 1.1 植物种子成熟调控网络与植物 lncRNA 的生物学功能Fig.1.1 Regulation network of seed maturation and the known lncRNA-mediatedprocesses1.2.4 植物 lncRNA 的作用机制许多 lncRNAs 的作用机制已在哺乳动物[51-55]中得到了阐释，并且很多研究表明 lncRNAs 与人类研究发育[56]、胚胎发育[57]、生殖细胞发育[58]以及人类疾病之间有着密切的联系[59-64]。然而在植物中只有很少 lncRNAs 的作用机理得到了阐释，可以归纳为以下几个方面：1）通过“目标模仿”（eTM）机制抑制 miRNA 的活性，进而调控基因的表达。最为经典的例子就是拟南芥 lncRNA-AtIPS1 可以模仿 miR399 的靶标PHO2，与 PHO2，竞争结合 miR399，从而促使 PHO2 的转录积累[65]。王秀杰实验室在拟南芥和水稻中分别鉴定了 36 和 189 个 eTMs，说明 lncRNAs 作为 eTM

研究方案与技术路线简图

2.1.1 植物材料拟南芥（Arabidopsis thaliana）Columbia 型，gus23（由加拿大农业部伦敦研究与开发中心崔玉海研究员实验室惠赠）。植株均培养于吉林大学和平校区边少敏教授所属培养室，根据实验需求不同，种植在草炭土与蛭石 3:1 的基质或MS 培养基中。2.1.2 菌株及载体由上海麦琪公司购买大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α 感受态细胞及农杆菌 GV3101 感受态细胞；用于 Gateway 载体构建技术中的入门载体 pDONR207由中国科学院植物研究所刘永秀研究员惠赠；植物载体、农杆菌双元表达载体pEarleyGate 100（含有 Bar 基因）由加拿大农业部伦敦研究与开发中心崔玉海研究员实验室惠赠，如图 2.1 所示。A B
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本文编号：2880425