非甲醇利用型毕赤酵母高表达重组蛋白菌株的构建及其转录组分析
发布时间：2020-11-12 07:53
毕赤酵母已广泛应用于重组蛋白的表达,这主要得益于其高效的P_(AOX1),该启动子受甲醇的严格诱导,在其它碳源,如甘油、葡萄糖等碳源存在的情况下会被抑制。目前已对甘油或葡萄糖条件下,P_(AOX1)的调控机制进行研究,发现调控P_(AOX1)表达的激活性转录因子有Mxr1、Prm1和Mit1,抑制性的转录因子为Nrg1和Mig,并通过对这些转录因子进行改造获得了非甲醇依赖型的毕赤酵母表达系统。甲醇具有易燃易爆、有毒等特点,这限制了毕赤酵母在大规模发酵、食品和医药产品中的应用。毕赤酵母代谢甲醇时,需要消耗大量的能量合成醇氧化酶,其表达量占总可溶蛋白的30%。本研究通过对毕赤酵母中甲醇代谢途径相关调控基因的改造,获得非甲醇利用型的高产重组蛋白菌株,并通过转录组学方法深入分析菌株改造后基因表达的情况。具体研究内容和结果如下:(1)非甲醇利用型毕赤酵母高表达重组蛋白菌株的构建通过Cre/lox基因编辑体系,对甲醇代谢调控相关基因进行连续敲除,获得了ΔAOX1-WT,ΔAOX1/2-WT,ΔAOX1/2-ΔMig1-WT,ΔAOX1/2-ΔMig1/2-WT,ΔAOX1/2-ΔMig1/2-ΔNrg1-WT菌株,将这5株菌在甘油和甲醇混合的BMGYM培养基中进行发酵,其中ΔAOX1/2-WT菌株在0.4%甘油+0.5%甲醇的BMGYM培养基中重组蛋白的表达水平是最好的,EGFP表达量较WT在BMMY中提高了53.6%。说明敲除AOX基因之后,有利于菌体提高重组蛋白的合成能力。(2)非甲醇利用型毕赤酵母高表达重组蛋白菌株的转录组学分析利用转录组学方法深入分析了AOX基因敲除之后菌体代谢途径相关基因的表达情况。根据对差异表达基因富集分析的结果显示,基因表达水平变化最多的是细胞的代谢途径和基因信息加工途径,并且这两条途径大部分基因的表达水平都是上调的。菌体通过下调甘油转运蛋白GT1和甘油降解途径相关基因的表达水平,缓解甘油对P_(AOX1)的抑制作用,实现在甘油存在的条件下P_(AOX1)的表达。在细胞代谢途径中菌体通过上调糖酵解途径和PPP途径中的非氧化途径,以及下调TCA循环为菌体代谢提供充足的前体、辅因子以及能量物质。菌体还通过上调蛋白质翻译阶段中核糖体蛋白表达水平和内质网中与蛋白质加工分泌相关的基因,来提高蛋白的分泌表达量。
【学位单位】：华南理工大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q78
【部分图文】：
第一章 绪论 的催化下与 NAD+作用脱氢生成甲酸和一个 NADH，甲酸在 FDH 的续脱氢生成二氧化碳和一个 NADH。经过这两步脱氢反应，最终生成体的生长提供能量[15]。该途径能够对甲醛和甲酸进行脱毒，并且发挥8]。在同化途径中，剩余的甲醛与过氧化物酶体中的 5-磷酸木酮糖（Xu合成酶（DAS）的催化下生成的二羟基丙酮（DHA）和 3-磷酸甘油醛胞质中以 6-磷酸果糖的形式参与到磷酸戊糖途径中，生成 Xu5P 和 新进入到过氧化物酶体中参与甲醇的代谢，那么甲醇代谢的终产物就P，可参与 PYR，TCA 和呼吸过程来为菌体的生长和代谢提供能量。
图 1-2 甲基营养型酵母甘油代谢途径通路[32]Methylotrophic yeast glycerol metabolic pathway. The main abbrees and products in metabolic pathways are shown below. GUP1, 2:n/transporter 1, 2, GCY1: glycerol dehydrogenase, DHAP: dihydro, DHA: dihydroxyacetone, GUT1: glycerol kinase 1, GUT2: glycerydroxyacetone kinase, F6P: fructose 6-phosphate, Xu5P: xylulose 5raldehyde 3-phosphate, PYR: pyruvate, PPP: pentose phosphate patricarboxylic acid cycle.上的另一种与甘油转运相关的跨膜蛋白 GT1，它能够由胞外向胞内外的渗透压平衡[33]。有研究表明，敲除 GT1 之后，在毕赤抑制方面都会产生影响，因此它在甘油调控 PAOX1活性的机理油转运体 GT1 通过与 MXR1 相互作用来调控 PAOX1的活性的-141 至-138 的 CCCC 序列是 MXR1 的结合位点，因此 MXR P的活性。过表达 GT1 后细胞内甘油含量增加，抑制 MXR
第一章 绪论合，这不足以促进 PAOX1的表达。因此在葡萄糖条件下，PAOX1是培养在甘油培养基中时，Mxr1从细胞质中转移到细胞核中同时与P核中的 Prm1 也结合到 PAOX1上，PMit1仍然受到 Nrg1 和 Mig 抑制， 与 PAOX1结合，Nrg1 依旧抑制 PAOX1的表达。由此可推测，Nrg1 在能和 Mxr1 和 Prm1 相似，从而竞争 PAOX1上的结合域来抑制 PAOX1条件下三种激活性转录因子都和 PAOX1结合，因此可以通过敲除 Mit1 来部分解除甘油对 PAOX1的抑制作用。在甲醇条件下，Mig 从细中，Nrg1 不再抑制 PAOX1和 PMit1的表达。Prm1 通过自激活高效表大量表达，累积的 Mit1 反过来抑制 Prm1 的表达，从而使细胞中 P个相对稳定的范围内。激活性转录因子 Mxr1，Prm1 和 Mit1 均与 处于高效表达的状态。
【参考文献】
本文编号：2880488
【学位单位】：华南理工大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q78
【部分图文】：
第一章 绪论 的催化下与 NAD+作用脱氢生成甲酸和一个 NADH，甲酸在 FDH 的续脱氢生成二氧化碳和一个 NADH。经过这两步脱氢反应，最终生成体的生长提供能量[15]。该途径能够对甲醛和甲酸进行脱毒，并且发挥8]。在同化途径中，剩余的甲醛与过氧化物酶体中的 5-磷酸木酮糖（Xu合成酶（DAS）的催化下生成的二羟基丙酮（DHA）和 3-磷酸甘油醛胞质中以 6-磷酸果糖的形式参与到磷酸戊糖途径中，生成 Xu5P 和 新进入到过氧化物酶体中参与甲醇的代谢，那么甲醇代谢的终产物就P，可参与 PYR，TCA 和呼吸过程来为菌体的生长和代谢提供能量。
图 1-2 甲基营养型酵母甘油代谢途径通路[32]Methylotrophic yeast glycerol metabolic pathway. The main abbrees and products in metabolic pathways are shown below. GUP1, 2:n/transporter 1, 2, GCY1: glycerol dehydrogenase, DHAP: dihydro, DHA: dihydroxyacetone, GUT1: glycerol kinase 1, GUT2: glycerydroxyacetone kinase, F6P: fructose 6-phosphate, Xu5P: xylulose 5raldehyde 3-phosphate, PYR: pyruvate, PPP: pentose phosphate patricarboxylic acid cycle.上的另一种与甘油转运相关的跨膜蛋白 GT1，它能够由胞外向胞内外的渗透压平衡[33]。有研究表明，敲除 GT1 之后，在毕赤抑制方面都会产生影响，因此它在甘油调控 PAOX1活性的机理油转运体 GT1 通过与 MXR1 相互作用来调控 PAOX1的活性的-141 至-138 的 CCCC 序列是 MXR1 的结合位点，因此 MXR P的活性。过表达 GT1 后细胞内甘油含量增加，抑制 MXR
第一章 绪论合，这不足以促进 PAOX1的表达。因此在葡萄糖条件下，PAOX1是培养在甘油培养基中时，Mxr1从细胞质中转移到细胞核中同时与P核中的 Prm1 也结合到 PAOX1上，PMit1仍然受到 Nrg1 和 Mig 抑制， 与 PAOX1结合，Nrg1 依旧抑制 PAOX1的表达。由此可推测，Nrg1 在能和 Mxr1 和 Prm1 相似，从而竞争 PAOX1上的结合域来抑制 PAOX1条件下三种激活性转录因子都和 PAOX1结合，因此可以通过敲除 Mit1 来部分解除甘油对 PAOX1的抑制作用。在甲醇条件下，Mig 从细中，Nrg1 不再抑制 PAOX1和 PMit1的表达。Prm1 通过自激活高效表大量表达，累积的 Mit1 反过来抑制 Prm1 的表达，从而使细胞中 P个相对稳定的范围内。激活性转录因子 Mxr1，Prm1 和 Mit1 均与 处于高效表达的状态。
【参考文献】
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本文编号：2880488
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