枯草芽孢杆菌体系高效表达锰过氧化氢酶的研究

发布时间：2020-11-13 01:32

　　 过氧化氢酶能够处理工业废水中残余的过氧化氢,所以它是在工业生产中一种重要的酶,但传统过氧化氢酶耐热性和耐酸碱性较差,这极大地限制了其在工业生产中的应用潜力。在之前的研究中,我们筛选并表达出一种新型的锰过氧化氢酶GeoMnCAT(GMC),具有较好的耐热性和耐酸碱性,能在75℃和pH 9.0的反应条件下达到最大酶活力,但其表达量较低且需要IPTG进行诱导表达。因此寻求更适合GMC表达的宿主菌株和基因表达组件以提高酶的表达是急需解决的问题。在本项研究中,锰过氧化氢酶GMC基因被构建于穿梭质粒pBS-S内,并以枯草芽孢杆菌RIK1285作为宿主菌株对锰过氧化氢酶GMC进行表达。同时,从信号肽文库中筛选出48种适于锰过氧化氢酶GMC表达的枯草芽孢杆菌同源信号肽(45种Sec信号肽,3种Tat信号肽)。随后选择3种不同类型的启动子(组成型启动子P_(43)、诱导型启动子P_(glv)、时期特异型启动子P_(aprE))插入到重组穿梭质粒中并从中筛选出最适于锰过氧化氢酶GMC表达的启动子。结果显示,Sec分泌途径的信号肽能更高效地促进外源蛋白的表达,其中信号肽yoqH能最大程度提高GMC表达量至46.08 U/mL。同时,我们通过SingalP软件计算得到不同信号肽的物理化学性质的参数,并将其与相应蛋白分泌水平的进行了相关性分析,发现代表分泌蛋白的N-末端氨基酸序列与信号肽之间的组合效率的D-score值与表达量呈负相关。在优化启动子后,组成型启动子P_(43)能够最大程度上提高锰过氧化氢酶GMC的表达量至143.77 U/ml。同时,诱导型启动子P_(glv)和时期特异型启动子P_(aprE)也能够较大程度上提高锰过氧化氢酶GMC的表达分别至115.33 U/mL和107.6 U/mL。相较于在大肠杆菌表达系统中产出的锰过氧化氢酶,经信号肽和启动子优化的在枯草芽孢杆菌中表达的锰过氧化氢酶最高被提升至其4.74倍。这项研究将锰过氧化氢酶GMC在枯草芽孢杆菌进行表达并通过分子水平优化,将锰过氧化氢酶的酶活提高至之前由大肠杆菌表达系统的4.74倍。这项工作为锰过氧化氢酶在工业的应用提供了可能性。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q78;Q936
【部分图文】：

也被称为触酶（Catalase，简称 CAT）。过氧化氢酶以 H2O2作为底物，通过酶活催化一对电子的转移进而将 H2O2分解成水和氧[2]。Sumner 于 1937 年得到牛肝过氧化氢酶结晶之后，生物学家开始尝试利用多样的方式从不同微生物以及动物组织中获取过氧化氢酶[3,4,5]，如在 1948 年 Pinsent 等首次从藤黄微球菌中提取到了锰过氧化氢酶。近年来研究发现，过氧化氢酶能够有效除去造纸、医药和纺织工业中的氧化剂-H2O2[6]可以作为一种替代化学处理、低成本且无污染的除 H2O2的方法[6,7]广泛应用于纺织业、食品工业、工业酶催化等。过氧化氢酶可依据获得途径的不同分为真核过氧化氢酶和原核过氧化氢酶，前者大部分来自于动植物组织，后者主要来源于微生物[7,8]。Goldberg 于 1989 年将过氧化氢酶按照结构和序列差异划分为三个亚群[9,10]，分别为单功能过氧化氢酶（Typical catalase）、双功能过氧化氢酶(Catalase-peroxidase, CAT-POD)和锰氧化氢酶(Mn-catalasee)。同时，以催化中心结构特点可分为(1)含铁卟啉结构的 CAT，又称铁卟啉酶；(2)含锰离子替代铁的卟啉结构的 CAT，又称锰过氧化氢酶(MnCAT)。

图 3.1 不同分泌途径的信号肽注：A, B, C 和 D 分别代表 Sec 依赖性信号肽，Tat 依赖性信号肽，ABC 依赖性信号肽和 P依赖性信号肽。箭头指向切割位点。1.5.2 Sec-SRP 分泌途径识别和定位作用。在合成前体蛋白后，细胞质伴侣保证了前蛋白在信号肽信号识别粒子（SRP）识别之前聚集了易位能力状态，并与 SRP 受体 FtsY 结36]。高度保守的核糖核蛋白复合物 SRP 由 scRNA 和两种类组蛋白蛋白（HBsu和 Ffh 组成，Ffh 是一种与 scRNA 相互作用并形成稳定复合物的含 446 个氨基的蛋白质。枯草芽孢杆菌的 SRP RNA 含有 Alu 结构域，其通过与结合核糖体延伸因子竞争来阻止蛋白质生物合成。延迟翻译使 SRP 有时间与其膜受体 Fts相互作用。DNA 结合蛋白 HU1（HBsu 的一部分）被认为是细菌 Alu 结构域一部分[39]。

图 2.1 穿梭质粒 pBE-S 质粒图谱穿梭质粒 pBE-S 包含: 2 个复制起始点（ColE ori 和 pUBori）、2 个抗性基Ampr和 Kanr）、1 个启动子 PaprE、1 个信号肽 aprE、1 段多克隆位点（MSC）.3 枯草芽孢杆菌感受态制备（1）将宿主菌株枯草芽孢杆菌 RIK1285 的甘油管菌液通过平板划线法接种 LB 培养基平板，37℃孵育过夜，约 16 小时。（2）用接菌环挑取生长状态良好的单菌落接种至 2 mL LB 培养基，28℃，0-180rpm 过夜培养。（3）将步骤（2）中培养液取 50μL 加入 5mL SP I 缓冲液中，37℃，180 rpm。加入 1 小时后开始，每 30 分钟测量 OD660 值以确定菌株生长情况，一旦培养入平台期便终止培养。（4）将步骤（3）中培养液取 0.5 ml 加入 4.5 mL SP II 缓冲液中，37℃，9000 rpm 下孵育 90 分钟。
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本文编号：2881537