家蚕BmPSI及其互作蛋白BmSPX对下游Bmdsx的调控研究

发布时间：2020-11-18 10:04

　　 家蚕是鳞翅目昆虫模式生物,其雌雄个体经济价值差异明显,因此对家蚕性别决定的研究不仅可为鳞翅目害虫防治提供参考,而且在养蚕业方面具有产业应用价值。先前研究发现位于家蚕性别决定信号通路下游的Bmdsx基因是家蚕性别分化开关基因,Bmdsx的不同选择性剪接形式决定了家蚕个体性别分化的方向。BmPSI(Byxbom mori P-element somatic inhibitor)蛋白可以特异地结合上Bmdsx pre-mRNA的第4外显子CE1元件,促进Bmdsx的雄性特异性剪接。当敲除BmPSI基因后,转基因家蚕个体中许多性别调控关键基因出现表达紊乱,下游最关键的Bmdsx的剪切形式出现变化,雄性个体中出现Bmdsx雌性剪接形式。另外,先前研究者曾构建家蚕酵母双杂交早期胚胎cDNA文库,并以BmPSI为诱饵筛选文库,发现了与BmPSI结合的剪接体蛋白——BmSPX,我们推测BmSPX可能参与家蚕Bmdsx的选择性剪切过程。为研究PSI调控dsx在昆虫物种间的保守性以及BmPSI互作蛋白BmSPX对下游Bmdsx选择性剪切的调控作用,我们设计实验方案,获得以下研究结果:1.BmPSI结构域与Bmdsx pre-mRNA的结合活性研究BmPSI蛋白包含4个KH_1结构域,该类结构域为RNA结合结构域,本研究构建分别删除其中1个KH_1结构域的截短蛋白表达载体,纯化这4种截短蛋白,将4种截短蛋白和全长BmPSI蛋白分别与CE1 RNA探针进行EMSA结合实验。结果显示,4个截短蛋白对CE1结合能力都减弱,其中删除了第一个和第二个KH_1结构域的2个截短蛋白与CE1结合能力最弱,这表明家蚕BmPSI蛋白结合CE1的能力由4个KH_1结构域共同提供,其中前面两个KH_1结构域起主要作用。2.BmPSI蛋白结合CE1关键氨基酸位点的发现及验证将4个KH_1结构域氨基酸序列进行多序列比对,根据前两个KH_1中保守氨基酸位点筛选影响BmPSI结合CE1探针的潜在关键氨基酸位点。同时基于先前文献报道,KH_1活性主要受内部保守锌肽重复序列Ile-Gly-X2-Gly-X2-Ile(IGGI)影响,本研究对BmPSI结合RNA能力的7个潜在关键氨基酸位点分别进行突变,过量表达并纯化这7种突变的全长BmPSI蛋白。将突变蛋白和CE1序列的RNA探针分别进行EMSA实验,结果发现其中I116G、L127G和mut IGGI这三种突变蛋白的结合能力明显减弱,利用EMSA冷竞争实验证实结合特异。利用圆二色光谱技术检测突变蛋白二级结构,结果显示三种突变蛋白与野生型BmPSI蛋白相比无明显结构差异,同时采用ITC(等温滴定量热法)对突变蛋白与CE1探针的结合亲和常数进行测定,结果发现这三种突变的引入都使BmPSI蛋白结合CE1探针的能力显著减弱。3.PSI结合dsx pre-mRNA在斜纹夜蛾中的保守性研究为研究PSI蛋白与CE1调控元件结合在鳞翅目昆虫中的保守性,本研究开展了家蚕以外的鳞翅目昆虫的PSI蛋白研究。基于斜纹夜蛾基因组计划已经完成,本研究分析了斜纹夜蛾基因组中双性基因(Sldsx)的序列信息,结果显示Sldsx的CE1元件序列与家蚕中序列完全相同。然后,对斜纹夜蛾SlPSI基因进行克隆,构建表达载体并纯化该蛋白。将SlPSI蛋白与CE1探针进行EMSA结合实验,结果显示SlPSI蛋白与CE1探针结合。根据家蚕BmPSI突变位点信息,对SlPSI相同氨基酸位点进行突变,后利用EMSA实验比较突变蛋白与CE1探针的结合能力,结果发现其中I116和IGGI两种位点对SlPSI蛋白结合RNA的能力具有重要的影响,而L127位点的突变对SlPSI结合CE1能力无明显影响。本研究结果表明PSI蛋白与dsx pre-mRNA中CE1元件的结合在鳞翅目昆虫中具有一定的保守性。4.家蚕BmPSI结合蛋白BmSPX的功能研究先前研究表明家蚕性别决定关键蛋白BmPSI可与剪切体蛋白BmSPX结合,为进行BmSPX的功能研究,本实验首先利用piggyBac转基因增量表达载体构建piggyBac-BmSPX重组载体,通过胚胎显微注射获得家蚕BmSPX增量表达品系Over-BmSPX,通过多代连续饲养及荧光筛选获得稳定携带红色荧光的转基因品系。提取转基因个体基因组,对转基因插入情况进行检测,发现BmSPX插入位点在第11号染色体基因间区。通过转基因个体cDNA实时荧光定量PCR检测,发现在转基因雄性个体中,BmSPX表达量上调了约30倍;而在雌性转基因个体中,BmSPX表达量上调了约4倍。综上结果可知,我们获得了稳定遗传的转基因BmSPX增量表达品系。对发育至蛾期的转基因增量表达BmSPX家蚕进行表型观察,同时观察到内生殖器和外生殖器的发育紊乱现象。因此我们推断BmSPX基因在雌、雄家蚕性别分化过程中均发挥重要作用。为研究BmSPX在家蚕性别决定中的生理功能,我们对Over-BmSPX转基因品系进行分子水平检测,检测到伴随BmSPX基因表达的明显上调,BmMasc、BmIMP和Bmdsx-F等基因表达量发生明显变化。同时,将BmSPX基因克隆到pSL1180过表达载体中,利用家蚕BmE细胞对家蚕BmSPX和BmPSI两种蛋白进行CO-IP(免疫共沉淀)实验,证实两者在家蚕细胞环境下存在相互作用。利用家蚕胚胎细胞系BmE细胞进行亚细胞定位,发现BmSPX蛋白属于核质穿梭蛋白。由于BmSPX具有精巢组织特异表达的性质,这与家蚕性别决定关键基因BmMasc精巢特异高量表达的情况一致,因此,我们利用CO-IP实验证明:BmSPX蛋白确实与BmMasc蛋白存在相互作用关系。结合转基因品系Over-BmSPX检测及以上其他实验结果,我们推断BmSPX蛋白作为Bmdsx雄特异性剪切阻遏复合体中的蛋白组分参与Bmdsx的选择性剪切。同时,BmSPX蛋白表达量的积累能够造成家蚕性别决定级联网络的调控变化,引起上游BmMasc、BmIMP的表达上调进而促进Bmdsx的雄特异性剪切,进而促进家蚕个体的雄性化发育。综上所述,本论文对家蚕性别决定关键蛋白BmPSI参与Bmdsx选择性剪接的关键氨基酸位点进行鉴定,首次发现除保守锌肽重复序列Ile-Gly-X2-Gly-X2-Ile外对KH_1结构域结合RNA能力具有显著调控作用的关键氨基酸位点I116,并发现PSI蛋白对双性基因dsx pre-mRNA关键元件CE1的结合在鳞翅目昆虫中具有一定保守性;通过多种分子手段证明可与BmPSI结合的家蚕剪接体蛋白BmSPX在家蚕性别决定中具有重要作用,使得家蚕性别决定级联调控进一步完善。
【学位单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q963
【部分图文】：

路定果蝇性别发育，该信号首先向下作用键开关基因[25]。性指数为 1 的信号向下使雌性果蝇个体早期表达 sxl 蛋白，而 sxl 蛋白[26, 27]。之后，sxl 建立性启动子发挥作用，sxl 基因开始转录出 pre-mR的活性 SXL 蛋白的影响，前体 mRNA 中 SXL 蛋白；而在雄性果蝇个体中，无法中的活性 SXL 蛋白可以向下传递信号至re-mRNA 的 3’剪切位点，促使有活性的的雄性个体中，TRA 蛋白的翻译提前终因是果蝇性别决定下游开关基因，雌性雌特异性剪切[32, 33]，果蝇个体发育为雌，dsx 基因产生雄特异性剪切，果蝇个体

图 1.2 P 元件 pre-mRNA 的不同组织细胞中的有效剪切（引自 Chmiel，2006）Fig 1.2 Productive spilicing of P-element pre-mRNA in germline cells and somatic cells1.3 家蚕的性别决定与果蝇不用，家蚕是典型的ZW染色体决定性生物，雄性个体染色体为ZZ雌性个体性染色体为ZW型，W染色体的存在与否决定了家蚕性别发育的方向[经过多年的研究，除性别决定下游开关基因 dsx 的选择性剪切决定性别分化的家蚕的性别决定通路与果蝇相比存在较大不同[50]。Bmdsx 基因作为家蚕性别关键开关基因在各组织均有表达，只是存在表达形式上的差异。Bmds

图 1.3 Bmdsx 的性别特异性选择性剪切Fig .1.3 Sex-specific alternative splicing of Bmdsx蚕性别通路蚕体内共 28 对染色体，雌性性染色体为 ZW 异配型，雄性性染色。W 染色体上存在由大量转座子控制元件和重复序列，因此很难鉴上的基因[58, 59]。Fem 基因就是在 W 染色体上发现的强雌性化作用性别决定的初始信号[60]。性染色体为 ZZ 的雄性家蚕个体中，促雄性化因子— BmMasc 基因调控雄性个体的剂量补偿效应，且促进 Bmdsx 的雄特异性剪接，雄性。而雌性家蚕性染色体为 ZW 型，只存在于雌性个体中的 W Fem 基因担任家蚕性别决定的初始信号[61]，该基因转录产生RNA 可与 BmMasc 基因 mRNA 中的一个区段互补配对，使 BmMasc[62, 63]，降解过程中产生一个 28nt 的 BmMasc-piRNA，这两种 piRNAi 两种蛋白的辅助下相互降解对方基因的 mRNA[64, 65]，最终到到了[66]
【参考文献】

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本文编号：2888597