第一部分:高原低氧适应藏、汉DNA甲基化谱研究研究背景:青藏高原环境缺氧,气温低,降水量少和紫外线辐射强,生存条件恶劣。藏族人与当地其他民族和移居高海拔的居民相比能很好地适应高原环境,表现在夜间睡眠时具有较高的通气形状参数值和低通气反应,他们不仅动脉血氧饱和度较低,而且血红蛋白浓度较低、睡眠质量较好。据相关报道,藏族人体内内皮细胞一氧化氮合酶的含量高于当地其他人,这就可以解释藏族人肺部较强的氧气扩散能力和明显增多的血流量。此外,藏族人对缺氧环境的适应性具有可遗传特征,如婴儿出生体重,运动后儿童和成人的血氧饱和度和血红蛋白水平。所有这些因素都使藏族能够适应并生活在高海拔地区。Simonson,TS等人研究发现,EGLN1和PPARA的单倍型与藏族人所特有的血红蛋白B表型呈现显著正相关。Beall CM和Yi X等报道EPAS1是经历了高阳性选择的高原适应的候选基因。Simonson TS,Wang GD和Yang L等人的研究证明EDNRA和YES1参与高海拔适应。然而,DNA甲基化作为重要的表观遗传学调控机制,很少有研究人员报道DNA甲基化水平的基因表达与缺氧适应之间的关联。Bernard Thienpont等人报道,肿瘤组织发生缺氧可引起氧依赖性TET酶的活性降低,TET酶通过5-甲基胞嘧啶氧化进而催化DNA去甲基化。这种生物学现象可以说明DNA甲基化与缺氧是相关的。Chiranjib Dasgupta等也提供引起启动子甲基化可增加缺氧的证据。研究方法:本研究,我们招募了 10名世居高海拔藏族(5名男性和5名女性;平均年龄:27.5岁),10名居民低海拔藏族(5名男性和5名女性;平均年龄:29.9岁),10名移居高海拔汉族(5名男性和5名女性;平均年龄:36.8岁)和10名普通汉族人(5名男性和5名女性;平均年龄:30.2岁)。使用基于微阵列的方法,找出世居藏族和移居汉族的差异性甲基化区域(DMR),通过京都基因与基因组百科全书(KEGG)对差异甲基化基因进行分析,对差异基因进行生物通路富集分析(IPA),并对其功能采用基因功能富集分析(Go)。结果:差异甲基化位点的KEGG分析提示,高海拔藏族与低海拔藏族在致心律失常性右心室心肌病,肥厚性心肌病,扩张型心肌病信号通路富集。移居高海拔汉族与低海拔汉族居民独特富集在:胰岛素信号通路和mTOR信号通路。启动子水平的KEGG分析提示,糖酵解/糖原异生通路是高海拔藏族居民与低海拔藏族居民比对后独有的。结论:揭示了世居高海拔藏族与移居低海拔藏族和移居高海拔汉族与低海拔汉族的全基因组DNA甲基化谱。此外,对差异甲基化位点和启动子水平的相应差异甲基化基因进行典型的功能注释分析。为探讨高原藏族居民与居民低海拔藏族和迁徙高原汉族与居民低海拔汉族人群DNA甲基化的表观遗传调控提供有价值的信息,为了解高原适应的机制提供新的见解和思路。第二部分:健康成人急性高原暴露后脑血管反应性的变化研究研究目的:研究健康成人不同海拔地区脑血管反应性(CVR)的变化及可能相关机制。研究方法:采用经颅多普勒联合CO2吸入CVR,采用近红外光谱(NIR)检测局部脑氧饱和度(rScO2)。采集血液标本,使用酶联免疫吸附法检测血清血管活性物质。本研究将59名健康成人分为低海拔组、中海拔组和高海拔组3组,低空组的所有指标均在出发前24小时和到达后测试。北京(海拔44.4米)到西宁(中等海拔2200米)。然后,休息48h后,所有指标在到达西宁后(24h和48h)(在2200米的中海拔高度)与玉树结古镇(海拔3700米)和中海拔高度进行了检测。对三个海拔高度的受试者进行组间比较。北京(海拔44.4米)到西宁(中等海拔2200米)。然后,在休息48小时后,所有指标在西宁(中等海拔2200米)到达玉树结古镇(海拔3700米)的24小时和48小时以及中等高度的所有指标进行测试。对三个高度的受试者进行了组间比较。结果:急性暴露于高原,低海拔组CVR升高,差异有统计学意义(CVR:1.94re为0.91±0.53,P0.001);CVRI升高,差异有统计学意义(脑血管储备指数(CVRI):3.65 HVCVR 与 1.37 E CVR,P0.001);rSc02 水平随海拔升高而降低,差异是(66.78±4.61)%vs(70.29±4.52)%,P0.001。急性高原暴露后低海拔组血管活性物质与暴露前相比下降:NO:(79.14±9.54)μmol/L vs(58.01±9.93)μ mol/L,P0.001;血清eNOS水平升高,差异有统计学意义[(77.23±6.20)pg/mL v(65.07±9.82)pg/ml,P0.001;EPO:(84.68±13.16)PG/ml 与(65.01±5.92)pg/ml,P0.001;VEGF:(71.91±11.62)pg/ml vs(54.92±11.86)pg/ml,P0.001;SFLT:(384.18±42.73)pg/ml vs.(320.62±78.96)pg/ml,p78.96。急性高原暴露后中海拔组CVR增加,差异有统计学意义(CVR:2±0.79 vs 0.91±0.66,P0.001);CVRI 差异显著(3.83±0.67 vs 1.67±0.87);P0.001;RSC02随海拔升高而略有下降,差异无统计学意义[(67.53±4.61)%vs.(69.63±5.59)%,P0.001]。在暴露于高海拔地区之前,NO、NOS低、中海拔组的EPO、VEGF和sFLT均高于高原组。不同海拔高度的CVR水平与SC02呈负相关(r=0.91),与NO和NOS水平呈正相关(RS=0.89,r=0.75);CVR 与 VEGF 和 EP0 中度相关(RS=0.45,r=0.42)。RSC02 与 RBC、Hb 和 VEGF 水平呈正相关(r=0.89,r=0.75,RS=0.86),但与 NO 和 NOS水平呈中度负相关(rs=-0.52,r=-0.57)。结论:低海拔受试者快速高原低氧暴露后,CVR升高,血清中的NO、eNOS、EPO等红细胞和血管活性物质显著升高,VEGF升高,随后逐渐降低,sFlt-1随着海拔的升高,逐渐升高,rSc02水平逐渐降低,表明高海拔地区的局部脑缺氧。第三部分:高原适应性基因MICU1在造血分化过程中的功能研究研究目的:根据前期研究结果藏、汉全基因组DNA甲基化谱,分析差异甲基化基因富集到的通路,我们选择钙信号通路,低氧适应相关线粒体钙离子摄入蛋白1进行相关实验研究。低氧可诱发低氧诱导因子HIF活化降低线粒体膜电位,活化的HIF进一步激活一系列因子引起线粒体自噬。线粒体膜电位降低后被自噬体清除,诱导线粒体自噬发生。线粒体功能紊乱导致钙稳态失衡,将引起细胞自噬、死亡。线粒体钙离子单向转运复合体(MCU、MICU1、MICU1)中线粒体钙离子摄入蛋白1(MICU1)是维持细胞线粒体钙稳态的重要分子,它是线粒体依赖性死亡途径的负调控因子。有研究发现,人在进入高原后,MCUR1的表达水平显著升高,提示MCUR1可能在适应高原环境过程中发挥作用。那么复合体中MICU1的功能如何?为此我们构建了稳定敲低MICU1的K562细胞系,并鉴定了载体的表达效果,探索MICU1在低氧时对红系分化的功能及其可能机制。探讨在低氧环境中MICU1对红系分化过程中调节作用及其对K562增殖、分化及凋亡的影响。研究方法:采用Western blot方法检测K562细胞系MICU1蛋白的表达情况。用慢病毒技术包装K562细胞,稳定敲低MICU1的表达,常氧、低氧培养,用qRT-PCR检测MICU1敲低效果,以及红系分化标志物cd235a、γ-globin表达情况,达标后采用westemblot检测MICU1、P53、BAX、Bcl-2的表达情况;用CCK8法检测了敲低MICU1后K562细胞的增殖;用ANNEXINV-APC/7-ADD检测了敲低MICU1后K562细胞系的周期和凋亡。结果:低氧可以抑制K562细胞的CD35a、y-globin的表达,抑制红系分化;CCK-8结果表明敲低MICU1可显著抑制K562细胞的增殖能力;流式细胞术实验结果表明敲低MCUR1可促进K562细胞凋亡;蛋白质免疫印迹实验表明敲低MICU1促进凋亡相关蛋白p53、BAX的表达,抑制BCL-2的表达。说明MICU1可促进K562增殖,抑制K562凋亡,促进了红系分化。结论:我们结果说明在K562细胞模型中,MICU1可以调控K562向红系分化,调控增殖、分化及凋亡过程,其调控K562分化、凋亡的过程可能通过调控MICU1的表达实现的。这进一步确定了 MICU1低氧诱导细胞红系分化的可能新机制。
【学位单位】：青海大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R339.5
【部分图文】：
吸取单个核细胞层（即血清与淋巴细胞分离液之间的公透明层）并移至另一只新的 15ml 离心管中。（5）公入 5ml 的 PBS，吹匀，离心 1000rpm，5min，RT，弃上清液，公入2ml 的红细胞裂解液，吹匀，离心 1000rpm，5min，RT，弃上清液，公入 5ml 的PBS，吹匀，离心（1000 转 5 分钟），弃上清液。（6）二次离心后可见离心管管底部白色团块状沉淀，弃上清，公入 2mlPBS分装到两个 EP 管，再次离心后，弃上清，标记管壁-80℃冰箱保存。基因组 DNA提取：使用 TIANampGenomicDNAKit（TiangenBiotech，Beijing，China）根据制造商的说明从血液中获得基因组 DNA。1.3.2 甲基化芯片 850K 检测(1)检测原理Illumina 的 Infinium 的甲基化检测技术原理是单碱基延伸原理，源于前期的SNP 检测。
（A/T 和 C/G）在捕获探针上进行单碱基延伸，只有公 gDNA 发生互补结合的探针才能得到延伸；通过染色， A/T 和 C/G 将分别标记公同的荧光染料；（9）芯片扫描，并利用软件根据两种荧光判读并输出甲基化水平结果。1.3.3 实验过程（1）样品质检检测将基因组 DNA，先用分光光度计定量，并将样品调到标准浓度 50ng/μL，20μL，然后用 0.8%的琼脂糖凝胶电泳。样品电泳主带清晰，通常公小于 10kb，没有明显降解，总量 5μg 以上，可进行下游的甲基化芯片实验。使用 NanoDrop2000 分光光度计（NanoDrop，ThermoScientific，Wilmington，DE，USA）测量提取的 DNA 的浓度。在 0.8％琼脂糖凝胶电泳中检查提取的 DNA 的质量。仅选择 DNA 纯度为 1.8 至 2.05 的血液样品用于微阵列研究，结果如下。
图 1.4 数据分析流程图3.6 数据分析使用 EZDNAMethylationTM 试剂盒（ZymoResearch，Irvine，CA）对来自个血液样品的大约 200 至 500ng 基因组 DNA 经过化学修饰和亚硫酸氢盐转，其将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，并且甲基化的胞嘧啶在处理期间保持变。Illumina850K 甲基化芯片在经过亚硫酸氢盐处理后，通过来自 Illumin（aSaniego，CA）的 InfiniumMethylationEPICBeadChip 微阵列根据制造商的说明测所有受试者的DNA甲基化状态，其测量分布在整个基因组上的853,307个CpG点的甲基化状态。使用 Illumina iScan 扫描仪提取图像强度，并在 RnBeads 中制质量，RnBeads 广泛用于大规模分析和 DNA 甲基化数据解释 56。
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2889096
