基于黄瓜绿斑驳花叶病毒的VIGS载体构建
发布时间：2020-12-09 02:57
葫芦科作物是我国重要的水果和蔬菜,新品种的培育需要挖掘重要农艺性状的基因。黄瓜、西瓜和甜瓜等多种葫芦科作物基因组已被测序,这为优异基因的挖掘及其功能研究奠定了基础。葫芦科作物的遗传转化耗时费力且转化效率极低,病毒诱导的基因沉默（Virus-induced gene silencing,VIGS）技术为葫芦科作物功能基因组学的研究提供了便利。本研究选择在自然条件下可侵染葫芦科作物的黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV）为材料,采用该病毒的侵染性克隆,首先摸索外源基因片段插入的位点、其次鉴定外壳蛋白（Coat Protein,CP）亚基因组启动子（Subgenomic Promoter,SGP）,再分析沉默效应,从而构建了可用于研究葫芦科植物基因功能的VIGS载体。本文主要的研究结果如下:（1）明确了插入位点在CGMMV CP基因终止密码子与3’非编码区之间,不适合用于构建VIGS载体。在CGMMV侵染性克隆pXT1-CGMMV的基础上,通过点突变和同源重组的技术采取分段扩增的方式获得含单酶切位点HindIII的病毒载体1a2...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：70 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
本研究的技术路线图
PCR 仪（RTC-100, MJ Research）；电泳仪（JY-ECP3000, 君意电泳）；凝胶成像io-Rad）；恒温水槽（DK-8D, 上海精密）；离心机（CF15RX, 日本 Hitachi）；电子天京塞多利斯）；紫外分光光度计（ND-1000, 美国 Thermo）；气浴培养摇床（HZ-市华利达）；组织研磨仪（TL2010S, 北京鼎昊源）。.2 试验方法.2.1 分析 pXT1 与 CGMMV 基因组序列的酶切位点将构建 CGMMV 侵染性克隆所用的植物表达载体 pXT1 的序列全长和 CGMMV 基 因 组 全 长 序 列 以 FASTA 格 式 输 入 在 线 搜 索 工 具 NEBhttp://nc2.neb.com/NEBcutter2/），分析序列中存在的酶切位点。.2.2 CGMMV CP 基因后插入位点的病毒载体的构建.2.2.1 构建策略首先，基于对 pXT1 和 CGMMV 序列中酶切位点的分析，发现这两条序列中均indIII 酶切位点，该酶切位点存在于 pXT1 序列的首部，在 CGMMV 基因组序列中与密码子共用一个碱基 T（如图 2.1）。
位论文 第二章 CGMM验室构建的一系列CP突变体对CGMMV的致氨基酸丝氨酸（TCG）突变为终止密码子（基因组序列中本存在的 HindIII 酶切位点作为 基因后插入位点构建病毒载体的策略为：首 HindIII 酶切位点和改变 CGMMV CP 基因ndIII-S 和 S159Z-X/S159Z-S；再以 DelHindIII组的 5' 端片段进行扩增，获得的片段长-S 为引物对 CGMMV 侵染性克隆的 3' 端片段用同源重组的方法将两个片段连接到一起，23。
【参考文献】：
期刊论文
[1]VIGS技术的研究进展及其在葫芦科作物中的应用[J]. 刘美,刘莉铭,吴会杰,古勤生. 果树学报. 2018(11)
[2]VIGS技术在观赏植物中应用的研究进展[J]. 陈峥,辛丽琴,吴超群,王青青,何少云. 北方园艺. 2016(13)
[3]VIGS载体在蔬菜作物中的应用研究进展[J]. 季娜娜,闵德栋,邵淑君,李富军,张新华. 植物生理学报. 2016(06)
[4]病毒诱导的基因沉默(VIGS)研究进展[J]. 宋震,李中安,周常勇. 园艺学报. 2014(09)
[5]病毒诱导的基因沉默技术及其在植物中的研究进展[J]. 张新华,李富军. 西北植物学报. 2012(02)
[6]Virus-induced gene silencing and its application in plant functional genomics[J]. HUANG ChangJun, QIAN YaJuan, LI ZhengHe & ZHOU XuePing* State Key Laboratory of Rice Biology, Institute of Biotechnology, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China. Science China(Life Sciences). 2012(02)
[7]防治监控黄瓜绿斑驳花叶病毒,确保瓜类安全生产[J]. 古勤生. 中国瓜菜. 2007(01)
博士论文
[1]矮牵牛转录因子PhOBF1和PhERF2影响病毒诱导基因沉默效率的机理研究[D]. 孙道阳.西北农林科技大学 2016
硕士论文
[1]草莓镶脉病毒（SVBV）启动子的鉴定[D]. 李瑞.安徽农业大学 2011
本文编号：2906130
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：70 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
本研究的技术路线图
PCR 仪（RTC-100, MJ Research）；电泳仪（JY-ECP3000, 君意电泳）；凝胶成像io-Rad）；恒温水槽（DK-8D, 上海精密）；离心机（CF15RX, 日本 Hitachi）；电子天京塞多利斯）；紫外分光光度计（ND-1000, 美国 Thermo）；气浴培养摇床（HZ-市华利达）；组织研磨仪（TL2010S, 北京鼎昊源）。.2 试验方法.2.1 分析 pXT1 与 CGMMV 基因组序列的酶切位点将构建 CGMMV 侵染性克隆所用的植物表达载体 pXT1 的序列全长和 CGMMV 基 因 组 全 长 序 列 以 FASTA 格 式 输 入 在 线 搜 索 工 具 NEBhttp://nc2.neb.com/NEBcutter2/），分析序列中存在的酶切位点。.2.2 CGMMV CP 基因后插入位点的病毒载体的构建.2.2.1 构建策略首先，基于对 pXT1 和 CGMMV 序列中酶切位点的分析，发现这两条序列中均indIII 酶切位点，该酶切位点存在于 pXT1 序列的首部，在 CGMMV 基因组序列中与密码子共用一个碱基 T（如图 2.1）。
位论文 第二章 CGMM验室构建的一系列CP突变体对CGMMV的致氨基酸丝氨酸（TCG）突变为终止密码子（基因组序列中本存在的 HindIII 酶切位点作为 基因后插入位点构建病毒载体的策略为：首 HindIII 酶切位点和改变 CGMMV CP 基因ndIII-S 和 S159Z-X/S159Z-S；再以 DelHindIII组的 5' 端片段进行扩增，获得的片段长-S 为引物对 CGMMV 侵染性克隆的 3' 端片段用同源重组的方法将两个片段连接到一起，23。
【参考文献】：
期刊论文
[1]VIGS技术的研究进展及其在葫芦科作物中的应用[J]. 刘美,刘莉铭,吴会杰,古勤生. 果树学报. 2018(11)
[2]VIGS技术在观赏植物中应用的研究进展[J]. 陈峥,辛丽琴,吴超群,王青青,何少云. 北方园艺. 2016(13)
[3]VIGS载体在蔬菜作物中的应用研究进展[J]. 季娜娜,闵德栋,邵淑君,李富军,张新华. 植物生理学报. 2016(06)
[4]病毒诱导的基因沉默(VIGS)研究进展[J]. 宋震,李中安,周常勇. 园艺学报. 2014(09)
[5]病毒诱导的基因沉默技术及其在植物中的研究进展[J]. 张新华,李富军. 西北植物学报. 2012(02)
[6]Virus-induced gene silencing and its application in plant functional genomics[J]. HUANG ChangJun, QIAN YaJuan, LI ZhengHe & ZHOU XuePing* State Key Laboratory of Rice Biology, Institute of Biotechnology, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China. Science China(Life Sciences). 2012(02)
[7]防治监控黄瓜绿斑驳花叶病毒,确保瓜类安全生产[J]. 古勤生. 中国瓜菜. 2007(01)
博士论文
[1]矮牵牛转录因子PhOBF1和PhERF2影响病毒诱导基因沉默效率的机理研究[D]. 孙道阳.西北农林科技大学 2016
硕士论文
[1]草莓镶脉病毒（SVBV）启动子的鉴定[D]. 李瑞.安徽农业大学 2011
本文编号：2906130
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/2906130.html
教材专著
